鲜铁皮石斛颗粒的质量标准研究

郭彩娥阮沛桦胡欣邓红杨小催周国彦甘国兴黄治

（1.清远市中医院药学部，广东 清远511500； 2.广东药科大学广东省药物新剂型重点实验室，广东 广州510006； 3.广东药科大学广东省局部精准药物递药制剂工程技术研究中心，广东广州510006）

鲜药是指未经任何可能导致药材成分改变或损失的手段加工处理的“原生药材”，在药材采收及粗加工后即可使用的中药原料。 铁皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）是一种名贵的中草药，又名铁皮斗、黑节草等，为兰科石斛属多年生附生草本植物的全草，其独特的生长环境和保健功效，使之有“救命仙草”的美誉［1］。 中医在用铁皮石斛时，常要求以铁皮石斛鲜品入药，鲜药的药理研究表明，其与干品的药理作用具有差异，鲜石斛性寒，其寒凉之性强于干品，所以石斛鲜品对热证的治疗效果优于石斛干品［2-4］。

清远市中医院、清远市鲜药制剂工程技术研究开发中心联合广东药科大学根据临床用药需要，选取鲜铁皮石斛为研究对象，以鲜药材投料，研制成颗粒剂，使之完全保留鲜药的特色，并解决鲜药的保鲜问题。 多糖为铁皮石斛的主要生物活性成分［5-6］，2015 年版《中国药典》规定铁皮石斛的总多糖按干燥品计算，不得少于25.0%。 多糖有淀粉性多糖和非淀粉性多糖之分，糊精、淀粉属淀粉性多糖，非淀粉性多糖是指淀粉以外的多糖。 申瑞玲等［7］采用酶-热水浸提法对藜麦麸水溶性非淀粉性多糖进行提取，效果良好，其中使用的酶为耐热-α-淀粉酶和糖化酶，本研究参考该方法，采用糖化酶酶解法消除辅料对铁皮石斛多糖测定的影响。 除多糖外，有研究表明，黄酮类成分也为铁皮石斛另一活性成分，有较强的抗氧化活性［8-9］，但黄酮类成分的鉴别等指标并未纳入2015 年版《中国药典》。 因此，本研究建立了鲜铁皮石斛颗粒的薄层鉴别方法，同时采用UPLC-PDA 法建立鲜颗粒特征图谱，制定较为完善的鲜铁皮石斛颗粒的质量标准，拟为其质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AcQuity UPLC（配置PDA，美国Waters 公司）；BSA224S-CW 型电子分析天平（赛多利斯仪器北京有限公司，感量：0.1 mg）；CP2250 型电子分析天平（赛多利斯仪器北京有限公司，感量：0.01 mg）；ZF-90 性暗箱式紫外透射仪（上海顾村电光仪器厂）；UV-1800 紫外-可见分光光度仪（日本岛津公司）；HK3300H 超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）；HWS-26 电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；TGL-20B 飞鸽牌离心机（上海安亭科学仪器厂）；XW-80A 旋涡混合器（上海精科实业有限公司）。

1.2 试药

鲜铁皮石斛颗粒（自制，批号分别为S1：180618；S2：180626-1；S3：180626-2；S4：180626-3；S5：180626-4；S6：180628；S7：180912；S8：190314-1；S9：190314-2；S10：190314-3；除批号S2、S3、S7 所用石斛药材产地为广东外，其余批号的产地均为云南）；芹菜素-6，8-二-c-葡萄苷对照品（质量分数：99.9%，批号：F0940192）、异夏佛塔苷对照品（质量分数：98.7%，批号：F0930336）、夏佛塔苷对照品（质量分数：99.31%，批号：F0850146）均购自中山市成诺生物科技有限公司；葡萄糖（批号：110833-201506，中国食品药品检定研究院）；糖化酶（批号：17122410，10 万U／mL，上海士峰生物科技有限公司）；乙腈、甲醇、四氢呋喃、磷酸为色谱纯；其他试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别［10］

2.1.1 供试品溶液的制备取鲜铁皮石斛颗粒3 g，用二氯甲烷-甲醇（体积比9 ∶1）振摇提取2 次，每次40 mL，滤过，合并滤液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。

2.1.2 对照药材溶液的制备取石斛对照药材0.2 g，加二氯甲烷-甲醇（体积比9 ∶1）15 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为对照药材溶液。

2.1.3 阴性对照溶液的制备按处方比例制备石斛阴性样品，照“2.1.1”项下方法制备阴性对照溶液。

2.1.4 薄层色谱条件薄层板：20 cm×10 cm 硅胶G 薄层板；点样量：供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液各5 μL；展开剂：甲苯-甲酸乙酯-甲酸（体积比9 ∶5 ∶1）；显色及检视：喷以10%硫酸乙醇试液，在95 ℃烘约3 min，置紫外光灯（365 nm）下检视。 结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，见图1。

2.2 特征图谱的建立

2.2.1 色谱条件AcQuity UPLC HSS T3 C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；体积流量：0.3 mL／min；检测波长：337 nm；柱温：30 ℃；进样体积：5 μL；流动相：四氢呋喃-乙腈-甲醇（10 ∶22 ∶5）为流动相A，质量分数0.05%磷酸为流动相B，梯度洗脱（0 ～9 min，9%→10%A；9 ～10 min，10%→11%A；10 ～12 min，11%→11.5%A；12 ～13 min，11.5%→14.5%A；13～20 min，14.5%→15%A；20 ～25 min，15%A；25～30 min，15%→38%A；30～32 min，38%→9%A）。

图1 薄层色谱鉴别图Figure 1 TLC chromatograms

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 供试品溶液的制备精密称取鲜铁皮石斛颗粒（批次180626-1）粉末1.5 g，置100 mL 具塞锥形瓶中，精密加入70%（体积分数，下同） 甲醇50 mL，称定质量，超声处理45 min（频率53 kHz，功率350 W），放冷，70%甲醇补足损失质量，滤过，取滤液25 mL 于蒸发皿蒸干，残渣加70%甲醇溶解移至5 mL 量瓶，并稀释至刻度，即得。

2.2.2.2 混合对照品溶液取芹菜素-6，8-二-c-葡萄苷、夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品适量，精密称定，置量瓶中，加70%甲醇制成每1 mL 约含各对照品10 μg 的溶液。

2.2.3 共有峰匹配和已知峰的指认精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各5 μL，按“2.2.1”项色谱条件下进样，记录特征图谱，并按国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”（2012A 版）进行共有峰匹配，结果10 批样品共匹配出6 个共有峰；经二极管阵列检测器对6 个共有峰的光谱扫描分析（220～380 nm），所代表的成分可定性为黄酮类物质，各成分的吸收峰见表1。 其中，峰1 为芹菜素-6，8-二-c-葡萄苷，峰3 为夏佛塔苷，峰5 为异夏佛塔苷；峰1 分离度较好，确认以峰1 为参比峰（见图2、图3）。

2.2.4 稳定性试验取供试品溶液（批号：180626-1），在0、2、4、8、12 h 分别依法进样，记录共有峰的峰面积和保留时间，计算共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD 值分别为1.24%～2.03%、0.45%～0.57%，表明供试品溶液在室温下12 h 内稳定性良好。

表1 6 个共有峰的紫外吸收波长Table 1 UV absorption wavelengths of six common peaks

图2 鲜铁皮石斛颗粒UPLC 图谱Figure 2 UPLC chromatograms of fresh Dendrobium officinale Kimura et Migo granules

图3 鲜铁皮石斛颗粒的特征图谱Figure 3 Characteristics chromatograms of fresh Dendrobium officinale Kimura et Migo granules

2.2.5 精密度试验取供试品溶液（批号：180626-1），连续进样6 次，记录共有峰的峰面积和保留时间，计算共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD 值分别为2.12%～3.07%和0.31%～0.45%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验取同批号颗粒（批号：180626-1），制备6 份供试品溶液，依法测定，记录色谱图，计算各已知峰的相对保留时间的RSD 值为0.35% ～1.26%；并采用国家药典委员会《中药指纹图谱相似度评价系统2012A 版》进行相似度评价其相关系数＞0.995，表明方法重复性良好。

2.2.7 特征图谱的建立精密吸取各批次供试品溶液5 μL，在“2.2.1”项色谱条件下进样，记录色谱图，以峰1 为参照峰，计算各特征图谱共有峰的相对保留时间，结果见表2。 可见，特征峰1～6 号与S 峰（峰1）的相对保留时间规定值为1.000（峰1）、1.261（峰2）、1.309（峰3）、1.396（峰4）、1.536（峰5）、1.688（峰6），各特征峰的相对保留时间在规定值的±3%之内。

表2 鲜铁皮石斛颗粒共有峰相对保留时间Table 2 The common peak relative retention time of fresh Dendrobium officinale Kimura et Migo granules

2.3 非淀粉性多糖质量分数的测定

2.3.1 辅料对多糖测定的影响分别称取鲜铁皮石斛颗粒约1.5 g，处方量的辅料（糊精∶淀粉＝2 ∶1，质量比）适量，精密称定，按《中国药典》铁皮石斛多糖含量测定项下方法操作，用紫外-可见分光光度计进行波长扫描（350 ～600 nm），记录光谱图，结果见图4。 可见，辅料在488 nm 处有吸收，辅料对鲜铁皮石斛颗粒剂的多糖测定有干扰。

2.3.2 糖化酶水解条件的考察糖化酶可特异性水解糊精、淀粉的糖苷键从而使它们降解为葡萄糖，参考文献［11］选取54 ℃作为酶解温度，考察糖化酶的加入量、酶解时间对消除辅料干扰的影响。

2.3.2.1 酶加入量称取辅料适量（约相当于1.5 g颗粒的辅料量）6 份，精密称定，分别置于100 mL 量瓶中，加入水50 mL，沸水加热至辅料分散均匀，冷却至室温后，分别加入1.0、1.5、2.0、3.0、5.0、8.0 mL（1 万U／mL）糖化酶溶液，54 ℃保温至样品溶液与碘试剂反应不变蓝。 冷却至室温，加水稀释至刻度，摇匀。 精密量取续滤液2 mL，置于15 mL 离心管中，精密加入无水乙醇10 mL，摇匀，冷藏1 h，取出，离心（转速为4 000 r／min）20 min，弃去上清液，沉淀加体积分数80%乙醇洗涤2 次，每次8 mL，离心，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至10 mL 量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得。 精密量取上述溶液1 mL，按《中国药典》铁皮石斛多糖含量测定项下测定法显色，在488 nm 的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，糖化酶溶液加入量为横坐标，绘制标准曲线，结果见图5。

图4 辅料对鲜铁皮石斛颗粒多糖测定的影响的UV 光谱图Figure 4 UV spectrogram of the effect of excipients on the determination of polysaccharide content

2.3.2.2 酶解时间称取辅料适量（约相当于1.5 g颗粒的辅料量）5 份，精密称定，分别置于100 mL 量瓶中，加入水50 mL，沸水中加热至辅料分散均匀。 冷却至室温，加入1.5 mL 糖化酶溶液，54 ℃条件下分别保温10、30、60、90、120 min。 冷却，加水稀释至刻度，摇匀。 按“2.3.2.1”项下自“精密量取续滤液2 mL，置于15 mL离心管中”同法操作，以吸光度为纵坐标，酶解时间为横坐标，绘制标准曲线，结果见图6。

可见，当酶解温度为54 ℃、酶加入量为1.5 mL、酶解时间为60 min 时，可消除辅料糊精、淀粉对测定鲜铁皮石斛颗粒中非淀粉多糖质量分数的干扰。

2.3.3 溶液的制备

2.3.3.1 供试品溶液的制备取鲜铁皮石斛颗粒，研细，取约1.5 g，精密称定，置100 mL 量瓶中，加50 mL 水，于沸水浴中使溶解，冷却至54 ℃下，加10%糖化酶溶液1.5 mL，加塞，于54 ℃保温1 h，加热煮沸5 min，冷却，用水稀释至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液2 mL，置于15 mL 离心管中，精密加入无水乙醇10 mL，摇匀，冷藏1 h，取出，离心（转速为4 000 r／min）20 min，弃去上清液，沉淀加80%乙醇洗涤2 次，每次8 mL，离心，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至10 mL 量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得。 备用。

图5 酶加入量的考察Figure 5 Investigation of the amount of enzyme added

图6 酶解时间的考察Figure 6 Investigation of enzymatic hydrolysis time

2.3.3.2 对照品溶液的制备取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖对照品9.06 mg，精密称定，置100 mL 量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，配制成90.6 μg／mL 的葡萄糖对照品溶液，备用。

2.3.3.3 阴性溶液的制备按处方量取辅料适量，精密称定，其余操作同“2.3.3.1”项方法，即得。

2.3.4 专属性的考察精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性溶液各1 mL，按苯酚硫酸法测定，精密加入5%苯酚溶液1 mL（临用配制），摇匀，再精密加硫酸5 mL，摇匀，置沸水浴中加热20 min，取出，置冰浴中冷却5 min，以相应溶剂为空白，用紫外分光光度计进行波长扫描，结果见图7。 可见，阴性对照不干扰测定，供试品溶液、对照品溶液在488 nm 波长处有最大吸收。

2.3.5 线性关系精密量取“2.3.3.2”项下对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.7、1.0 mL 于10 mL 具塞试管中，各加水补至1.0 mL，其余步骤按“2.3.4”项下方法，以相应溶剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在488 nm 波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y＝10．928X- 0．010 3（r＝0.998 4），说明D-无水葡萄糖在18.12 ～90.6 μg／mL 范围内与吸光度具有良好的线性关系。

图7 专属性试验光谱图Figure 7 Spectrogram of specificity test

2.3.6 稳定性试验精密吸取“2.3.3.1”项下供试品溶液1 mL，按“2.3.4”项下方法显色后，于0、1、2、3、4 h 测定吸光度值，测得供试品溶液吸光度RSD 为0.33%，表明供试品溶液在4 h 内稳定性良好。

2.3.7 精密度试验精密吸取“2.3.3.1”项下供试品溶液1 mL，按“2.3.4”项方法显色，依法连续测定6 次，测得6 次吸光度值RSD 为0.00%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.3.8 重复性试验精密称取石斛颗粒（批次180626-1）6 份，按“2.3.3.1”项方法制备溶液，按“2.3.4”项方法显色后测定吸光度，代入标准曲线计算得6 份样品平均质量分数为3.17%，RSD 为3.10%（n＝6），表明方法重复性好。

2.3.9 加样回收率试验精密称取已知含量的鲜铁皮石斛颗粒（批次180626-1）6 份，按“2.3.3.1”项方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液0.5 mL，置于比色管中，加入0.5 mL 已知含量的葡萄糖对照品溶液（约0.063 4 mg／mL），按“2.3.4”项方法显色，测定吸光度，计算加样回收率，结果见表3。 可见，平均加样回收率为99.78%，RSD 值为2.38%，表明方法准确度良好。

2.3.10 鲜铁皮石斛颗粒中非淀粉性多糖的质量分数取不同批次的鲜铁皮石斛颗粒，按“2.3.3.1”项下方法制备溶液，按“2.3.4”项下方法测定吸光度值，通过回归方程计算供试品溶液中非淀粉性多糖的质量分数，结果见表4。

表3 加样回收率试验结果Table 3 Results of sample recovery test（n＝6）

表4 10 批鲜铁皮石斛颗粒中非淀粉性多糖的测定结果Table 4 Determination of non-starch polysaccharides in fresh Dendrobium officinale Kimura et Migo granules（n＝3）w／%

3 讨论

3.1 薄层色谱鉴别

本文参考《中国药典》方法建立了颗粒剂的薄层鉴别方法，结果斑点清晰，阴性无干扰。

3.2 特征图谱的建立

铁皮石斛中的活性成分主要为多糖、黄酮苷类成分，本研究初步建立了10 批铁皮石斛颗粒的特征图谱，标出6 个共有特征峰，经二极管阵列检测器对共有峰的光谱扫描分析，所代表的成分可定性为黄酮类物质，特征图谱的建立能更全面反映制剂的质量。

3.3 非淀粉性多糖的测定

铁皮石斛多糖由非淀粉性多糖、淀粉性多糖、蛋白和灰分等组成，其中非淀粉性多糖占比78.21%［12］，是多糖的主要组成部分，《中国药典》采用的是苯酚硫酸法来测定铁皮石斛总多糖的质量分数。 鲜铁皮石斛颗粒成型过程中加入了辅料淀粉、糊精，两者均属淀粉性多糖，经浓硫酸水解后产生单糖，会与苯酚反应从而影响多糖质量分数测定的准确性，因此，本文采用酶解法消除辅料对多糖测定影响的方法。 其作用原理是糖化酶能从淀粉、糊精等淀粉性多糖物质碳链上的非还原性末端逐渐水解α-1，4 糖苷键，最后水解为葡萄糖，在80%乙醇沉淀过程中与非淀粉性多糖分离，可达到去除淀粉性多糖杂质的目的。由于本法使用的对照品为葡萄糖，在加样回收试验中如果在第一步酶解试验中加入对照品，对照品会溶于80%乙醇造成损失，所以只能在第二步（硫酸水解-苯酚显色）加入以考察检测方法的准确性。

本研究方法可同时应用于原药材铁皮石斛非淀粉多糖的测定，经对投料药材非淀粉性多糖的测定，根据投料量、收得率计算颗粒的理论含量，10 批颗粒的非淀粉性多糖的转移率分别为93.5%～102.8%，与实际工艺情况相符，进一步验证了方法的准确性。

目前，常见的除去淀粉等物质对多糖含量测定影响的方法有AOAC Roberts 铜法、酶解法［13］等。AOAC Roberts 铜法的作用原理是在碱性条件下，铜离子选择与具有葡聚糖结构的多糖结合生成沉淀。与酶解法相比，AOAC Roberts 铜法需要多次洗涤，操作繁琐，结果受操作影响较大。

糖化酶是一种大分子量的糖蛋白，其中含有的组分包括葡萄糖、糖醛酸、甘露糖和半乳糖。 本研究对酶的加入量进行了考察，结果表明糖化酶用量在1.5～2.0 mL（1 万U／mL）时可消除辅料的干扰，糖化酶加入量过多，吸光度反而升高，对测定的干扰更大。原因可能是过量的糖化酶在80%乙醇洗涤步骤中无法完全除去，因此影响实验结果的准确性。 为了减少糖化酶用量对实验的影响，糖化酶加入量应适度。