巨噬细胞极化中特异性分子表达的实验研究

王乐旬张盛昔吴惠娟韦曲星胡因铭郭姣

（广东省代谢病中西医结合研究中心／广东省代谢性疾病中医药防治重点实验室／粤港澳联合代谢病重点实验室／广东药科大学中医药研究院，广东 广州510006）

巨噬细胞作为固有免疫的重要组成细胞，在器官发育、急慢性炎症、机体抵抗病原体、组织修复和稳态以及免疫调节等生理和病理过程中发挥着重要作用［1］。 巨噬细胞主要包括两种：来源于胚胎期卵黄囊的组织定居巨噬细胞（tissue resident macrophages）和来源于外周血单核细胞的巨噬细胞（monocyte-derived macrophages）［2］。 极化（polarization）是巨噬细胞的重要特点。 根据其周围的刺激不同，巨噬细胞可极化成具有不同表型和功能的细胞类型。 现在普遍接受的观点是巨噬细胞可分为两型，即M1 型和M2型，M2 又分为M2a、M2b 和M2c 3 个亚型［1，3］。

M1 型巨噬细胞，又称为经典活化的巨噬细胞（classical activated macrophages），可释放大量的炎症因子，具有抗血管形成、抗胶原蛋白合成以及清除病原体的作用［1，4-5］。 M2 型巨噬细胞，又称选择性活 化 的 巨 噬 细 胞 （ alternatively activated macrophages），可进一步分为3 种：M2a 型巨噬细胞，又称为损伤修复巨噬细胞（wound-healing macrophages），可产生多种抑炎因子，发挥抑制炎症反应、促进血管生成、胶原蛋白形成和细胞外基质沉积的作用；M2b 型巨噬细胞，又称为调节性巨噬细胞（regulatory macrophages），是一类新近发现的巨噬细胞，以产生大量IL-10 为特征，具有强大的抑炎和免疫抑制作用；M2c 型巨噬细胞，也成为获得性失活巨噬细胞（acquired deactivation macrophages），产生多种抑炎因子，发挥免疫抑制、促进血管生成、胶原蛋白形成等作用，还具有细胞吞噬功能，清除死亡的细胞［1，4-6］。 尽管国内外对巨噬细胞极化进行了深入的研究，现如今没有被普遍接受的极化特征性的分子标记［4］。

本研究利用骨髓来源的巨噬细胞，验证不同极化的诱导方法，并检测不同极化状态下的分子标记以及相关信号通路，为巨噬细胞极化的体外实验提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8～10 周的雄性C57BL／6 小鼠购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2018-0002。

1.2 试剂

F4／80-FITC 荧光抗体、CD206-APC 荧光抗体、CD38-APC 荧光抗体、青／链霉素、EDTA 溶液、鸡卵清白蛋白（VOA）、VOA 抗体、HRP 标记的羊抗鼠IgG 和羊抗兔IgG 购自Thermo Fisher Scientific 公司；封闭抗体anti-mouse CD16／32 为BioXcell 公司产品；LIGHT- Alexa Fluor 647 荧光抗体为R＆D Systems 公司产品；RPMI-1640 培养基、DMEM 培养基和胎牛血清为Gibco 产品；重组小鼠M-SCF、INFγ、IL-10、IL-13 和IL-4 为PeproTech 公司产品；红细胞裂解液、LPS（O55：B5）购自Sigma-Aldrich 公司；GAPDH 抗体购自ProteinTech 公司；p-p65、p65、p-p38、p38、p-ERK 和ERK 抗体购自Cell Signaling Technology 公司；NC 膜为Millipore 公司产品；ECL发光液为武汉聚能慧达生物科技有限公司产品；RNAiso-Plus 试剂为TAKARA 公司产品；CXCL9、CXCL13、CCL17 和CCL1 的ELISA 试剂盒为上海吉泰依科赛生物科技有限公司产品；逆转录试剂盒和荧光定量PCR 试剂盒购自TOYOBO 公司；蛋白定量试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、Western 细胞裂解液为上海碧云天生物技术公司产品。

1.3 主要仪器

LightCycler 480 荧光定量PCR 仪为Roche 公司产品；5810R 低温离心机为Eppendorf 公司产品；NanoDrop 2000 核酸浓度测定仪为Thermo Fisher Scientific 公司产品；CytoFlex 流式细胞仪为Beckman公司产品；Mithras LB-940 酶标仪购自德国Berthold公司；电泳仪及转膜仪为Bio-Rad 公司产品。

1.4 骨髓细胞的提取

小鼠骨髓提取过程详见参考文献［7］。

1.5 巨噬细胞的诱导

用含有青／链霉素及10%（φ）的FBS 的DMEM培养基重悬骨髓细胞，于细胞培养箱中培养3 h 后，将未贴壁的细胞离心，重悬于含有双抗、10 ng／mL的M-CSF 和10%FBS 的DMEM 培养基，于培养箱中培养，隔天换液。 M-CSF 诱导7 d 后，用0.2%的EDTA 消化细胞；然后常温1 500 r／min，离心5 min；不含血清的DMEM 培养基重悬细胞并计数；按1.0×106个／孔，进行种板；待细胞贴壁后（6 ～8 h），参照巨噬细胞体外诱导的方法［1，5］：M0：不加任何刺激因子；M1：100 ng／mL LPS ＋10 ng／mL INF-γ；M2a：20 ng／mL IL-4＋10 ng／mL IL-13；M2b：100 ng／mL LPS＋50 ng／mL 免疫复合物（IC，VOA 15 μg／mL＋VOA 抗体150 μg／mL，37 ℃孵育30 min）；M2c：10 ng／mL IL-10，继续培养12 h、24 h 或48 h，收集培养上清、mRNA 和蛋白质，用于后续的检测和实验。

1.6 Q-PCR 检测细胞中相关基因mRNA 的表达

mRNA 提取过程详见参考文献［8］。 引物由Invitrogen 上海公司合成，序列见表1。 按照Q-PCR试剂盒进行加样、上机运行。GAPDH作为内参，将所得Ct值按2-△△Ct方法进行数据处理。

1.7 Western blot 检测细胞中相关蛋白的表达

收集细胞蛋白，按照蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，煮沸后进行SDS-PAGE 凝胶电泳，经湿转法将胶中蛋白转至NC 膜上，用5%BSA（TBST 稀释）封闭，孵育相应蛋白的一抗（p38、ERK、p65、p-p38、p-ERK、p-p65、GAPDH，按照1 ∶1 000稀释），TBST 洗涤3次，孵育二抗（山羊抗兔，按照1 ∶10 000稀释），TBST 洗膜4 次，ECL 发光液显色，胶片于暗室中曝光，晾干胶片，扫描分析。

1.8 流式细胞仪检测

收集骨髓细胞、M-CSF 刺激的巨噬细胞或不同型别的巨噬细胞，用PBS 洗涤后，加入抗体结合缓冲液100 μL 和封闭抗体5 μL，振荡混匀，静置15 min。 然后分3 组加入抗体：F4／80 组加入1 μL F4／80 抗体，ISO 组加入1 μL 同型对照抗体，Con 组不加抗生素抗体，混匀后室温避光孵育20 min，离心，PBS 洗涤1 次，用300 μL 的PBS 重悬，上机进行流式细胞检测。

1.9 统计学方法

采用GraphPad Prism7 软件进行统计分析，计量资料采用（±s）表示。 样本数据首先进行正态性检验和方差齐性检验，对于符合正态分布且方差齐性的数据，采用单因素方差分析（ANOVA），多重比较采用Tukey 检验；不符合正态分布或方差不齐的数据采用H检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

表1 Q-PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for Q-PCR

2 结果

2.1 原代骨髓巨噬细胞的验证

首先对骨髓原代细胞进行流式分析，以验证原代细胞中巨噬细胞所占的比例。 结果如图1 所示，诱导前巨噬细胞指征性分子（F4／80）阳性率很低，为（4.39±2.33）%。 经过M-CSF 7 d 的诱导，骨髓细胞绝大部分都分化成了巨噬细胞，F4／80 阳性率为（91.4±5.65）%。 这表明原代骨髓细胞在M-CSF 诱导下分化成了巨噬细胞，为后续的实验打下基础。

2.2 巨噬细胞极化的诱导

对巨噬细胞诱导12 h，然后通过Q-PCR 检测不同诱导方式下巨噬细胞特异性分子的mRNA 水平变化。 结果如图2 所示，LPS＋INF-γ 处理组能够显著诱导CXCL9 mRNA 水平的增加；IL-4＋IL-13 处理组能够显著刺激CCL17 mRNA 的转录；LPS＋IC 处理组能够显著增加CCL1 和IL-10 的mRNA 水平；IL-10 的处理能够刺激CXCL13 mRNA 的增加。

蛋白水平上，培养上清中CXCL9 的水平在LPS＋INF-γ 处理组中最高，IL-4＋IL-13 组能显著增加上清中CCL17 的蛋白水平，LPS＋IC 组能够刺激CCL1蛋白的表达和分泌，IL-10 处理组能够增强CXCL13的蛋白表达（图3）。 此外，上清中的IL-10 的水平在LPS＋IC 处理组中是最高的（图3）。

图1 流式检测原代巨噬细胞的比例Figure 1 Proportion of primary macrophages tested by flow cytometry

图2 不同处理对巨噬细胞中相关分子mRNA 水平的变化的影响Figure 2 Changes of mRNA levels of related molecules in macrophages by different treatments

2.3 巨噬细胞极化的表面分子分析

结果如图4 所示，LPS 能够显著诱导CD38 蛋白的表达并定位在细胞膜上。 本课题组也检测了作为M2 巨噬细胞的常用分子标记CD206 蛋白［1］。 结果显示，IL-4＋IL-13 处理以及IL-10 处理能够增强其表达。 另外，LPS＋IC 能够刺激LIGHT 蛋白的表达（图4）。 结果表明，在流式分析中，CD38 蛋白可作为M1 巨噬细胞特异性的分子标记；LIGHT 蛋白可作为M2b 巨噬细胞特异性的分子标记。

图3 不同处理对细胞培养上清中相关分子蛋白水平的变化的影响Figure 3 Changes of protein levels of related molecules in macrophages by different treatments

图4 流式细胞仪检测不同型别巨噬细胞中表面分子的表达Figure 4 Expressions of surface molecules in different macrophage subtypes by flow cytometry

2.4 不同刺激对细胞信号通路的影响

对信号通路相关蛋白的检测结果如图5 所示，LPS＋INF-γ 以及LPS＋IC 能够诱导p38 的活化；ERK蛋白在LPS＋IC 处理下被激活；磷酸化的p65 蛋白在LPS＋INF-γ 处理组中表达最高。

图5 不同刺激对细胞信号通路的影响Figure 5 Effect of different stimulation on cell signaling pathway

3 讨论

巨噬细胞因其在器官发育、内环境稳态的维持、组织修复、抵抗病原菌和肿瘤发生发展等方面扮演着重要作用而备受关注，成为研究热点［2］。 鉴于巨噬细胞几乎存在于所有的组织器官中［2］，近年来的研究不仅从体内实验揭示其极化状态及功能，还从体外实验中研究其发挥作用的分子机制。 在体外实验中，LPS＋INF-γ 诱导M1 型巨噬细胞，IL-4＋IL-13诱导M2a 型巨噬细胞，LPS＋IC 诱导M2b 型巨噬细胞以及IL-10 诱导M2c 型巨噬细胞的诱导方法是主流的极化方法［1，3-5，7］。 本研究证实，在体外实验中，CXCL9 和CD38 蛋白主要在M1 巨噬细胞中表达，CCL17 主要在M2a 巨噬细胞中表达，CCL1 和LIGHT 蛋白主要在M2b 巨噬细胞中表达， 而CXCL13 主要在M2c 巨噬细胞中表达。

CXCL9 属于CXC 趋化因子家族成员，可由包括巨噬细胞和T 淋巴细胞等免疫细胞以及内皮细胞等非免疫细胞合成和分泌，与靶细胞上的受体CXCR3 结合，在免疫细胞趋化中起重要作用［9-10］。M1 巨噬细胞可大量合成和分泌CXCL9，但考虑到其他细胞也可分泌CXCL9，在体内研究中一般不将CXCL9 作为M1 的分子标记［1，5，11］。 本研究证实，和其他几个组相比，在LPS ＋INF-γ 联合诱导组中，CXCL9 的mRNA 和蛋白质水平都显著升高。 这表明，在体外实验中，CXCL9 可指示巨噬细胞向M1 型方向极化。 和CXCL9 一样，CXCL13 也属于CXC 趋化因子家族成员，可由巨噬细胞和单核细胞等分泌，可与炎症免疫细胞上表达的CXCR5 结合，调控靶细胞的功能及趋化［12］。 文献报道M2c 巨噬细胞可分泌大量的CXCL13，并将其作为M2c 细胞的分子标记［1，4，11］。 本研 究 结 果 证 实，和 其 他 处 理 组 相 比，CXCL13 在IL-10 处理中的mRNA 和蛋白水平是最高的。

CCL1 是第1 个被发现的CC 趋化因子家族成员［1］。 除了单核细胞和巨噬细胞外，T 细胞、肥大细胞和DC 细胞都可以分泌CCL1［1］。 有研究显示，CCL1 不仅是M2b 巨噬细胞特异性分泌，而且也是其维持极化状态的关键因子［1，13］。 在本研究中，和其他几个处理组相比，LPS ＋IL 处理组中CCL1 的mRNA 和蛋白水平是最高的。 另外，作为CC 趋化因子家族的另一成员，CCL17 可由巨噬细胞、DC 细胞和成纤维细胞等分泌，与T 淋巴细胞上的CCR4结合，并诱导其趋化［14］。 研究显示，M2a 巨噬细胞可大量分泌CCL17［5，15］。 在本研究中，和其他几个处理相比，IL-4＋IL-13 处理组中CCL17 的mRNA 和蛋白水平是最高的。

LIGHT，又被称为TNFSF14 或CD258，主要表达在T 淋巴细胞以及未成熟的DC 细胞上，发挥激活免疫细胞的作用［16］。 自从2006 年报道以来，越来越多的研究显示在区别不同极化巨噬细胞时，LIGHT 蛋白是M2b 巨噬细胞的特异性分子标记［1，13，17-18］。 本研究证实LIGHT 蛋白主要是在M2b巨噬细胞中表达。 结果提示，在体外实验中区别不同型别巨噬细胞时，LIGHT 可以将M2b 巨噬细胞鉴定出来。

CD38 是表达在巨噬细胞、单核细胞、NK 细胞等免疫细胞膜表面的一种蛋白分子，具有重要的生理和病理作用［19］。 最近研究显示，在不同型别的巨噬细胞中，CD38 蛋白主要在M1 巨噬细胞中表达［5，20］。 流式结果证实，CD38 蛋白主要是在M1 型巨噬细胞中表达。 这提示CD38 蛋白可以作为M1巨噬细胞流式检测的特异性分子标记。

IL-10 是一种具有强大抑炎功能的细胞因子，作为区别M1 和M2 巨噬细胞的分子标记已被广泛接受［1，3-4］。 但是，在高表达IL-10 的M2 巨噬细胞中，M2b 巨噬细胞表达量最高［5］。 另外，相对M2 巨噬细胞，M1 巨噬细胞表达IL-10 的水平是降低的，但和M0 巨噬细胞相比，其表达IL-10 的水平也是升高的［5］。 本研究也证实了这一点。 这表明，如果单独利用IL-10 鉴定其中一个型别，往往会产生误导。所以，如果想利用IL-10 作为巨噬细胞极化的一个分子标记，最好和其他分子标记一起使用。

综上，在体外实验中从mRNA 水平或／和蛋白水平上检测巨噬细胞的极化，可用CXCL9 作为M1 的特征性分子，CCL17 作为M2a 的特征性分子，CCL1 作为M2b 的特征性分子，CXCL13 作为M2c 的特征性分子；从流式检测的角度，可用CD38 蛋白作为M1 的特征性分子，LIGHT 作为M2b 的特征性分子。