乙醇钠预处理木质纤维素原料的组分及结构特性*

李 想 陈 妮 齐学敏 楚 杰 张军华 常德龙 许雅雅

(1.西北农林科技大学 杨凌 712100；2.国家林业和草原局泡桐研究开发中心 郑州 450003)

近年来，利用木质纤维素原料生产燃料乙醇备受瞩目(Talebniaetal.，2010；Jørgensenetal.，2007；Himmeletal.，2007；Snchezetal.，2008)。预处理是木质纤维素原料生产燃料乙醇的关键步骤(Zhuetal.，2009)，其直接影响木质纤维素的水解效率和燃料乙醇的生产成本，研发高效、低成本的预处理技术，能够与其他生物炼制操作结合并降低环境污染，对于可持续生物精炼，整合生产食品、饲料、化学品、材料、商品和燃料的发展具有重大意义(祝其丽等，2015；亓伟等，2013；董浩亮，2015；刘芳，2015)。我国木质纤维素原料产量很高，但由于预处理技术尚不成熟，限制了其高值化利用(贺文明等，2010)。目前，国内外对木质纤维素原料的预处理方法主要有物理法、化学法、物理化学法和生物法，其目的旨在优化生物转化效率预处理时间、温度以及预处理化学试剂的选择等因素，对预处理效果具有非常大的影响。高效经济的预处理方法应满足以下六大点要求：1) 能够打破木质纤维素的三维结构，降低其分子聚合度和纤维素结晶度；2) 增加材料的表面积和孔隙率；3) 产生高度可消化的预处理固体且在水解后促进糖产率(纤维素转化产率大于90%)；4) 避免形成发酵抑制剂化合物(特别是乙酸)；5) 便于半纤维素和木质素回收；6) 能源、化学品和水的投入少，并使用简单、规模合理和低成本的反应堆(孙宗苹等，2012)。

本研究以3种常见木质纤维素原料——针叶材松木(Pinus)、杉木(Cunninghamialanceolata)和阔叶材水曲柳(Fraxinusmandschurica)为研究对象，采用乙醇钠进行预处理，并对预处理木质纤维素原料的主要化学组分变化及结构特性进行分析，力求获得纤维素组分含量大、除木素效果好的高效益预处理方法，以提高木质纤维素原料的酶水解效率，为纤维素原料制备生物乙醇燃料的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

水曲柳、松木样品购自陕西中兴林产有限公司，杉木样品由芬兰LUKE公司提供。3种原料经干燥、剪切、烘干后粉碎机粉碎，过80目筛网，装入自封袋并标记名称日期等，冰箱冷藏待用。

试验中使用的乙醇钠、H2SO4、碳酸钙、溴化钾、乙醇等均为分析纯。预处理及化学组分测定所用仪器包括水浴锅、电子天平、真空泵、干燥箱、离心机、紫外可见分光光度计、振荡器、粉碎机、高压灭菌锅等；葡萄糖、木糖含量使用高效液相色谱(HPLC)进行检测。

1.2 原料预处理

配制质量分数1.5%的乙醇钠溶液500 mL，分别称取松木、杉木、水曲柳3种干物质原料10 g于烧口瓶中，加入120 mL配好的乙醇钠溶液，拧紧瓶盖，置于高压灭菌锅中进行预处理，预处理参数参考Yang等(2010)，具体反应条件见表1。反应完成后用蒸馏水将原料洗至中性烘干备用。

表1 原料预处理试验方案①Tab.1 Test scheme for raw material pretreatment

①1、2、3分别代表松木、杉木、水曲柳；料液比为1∶10。1,2,3 represent separatelyPinus，CunninghamialanceolataandFraxinusmandschurica.The ratio of material to liquid is 1∶10.

1.3 主要化学组分测定

松木、杉木、水曲柳样品三大素含量测定参照美国能源部(NREL)方法。

1.3.1 纤维素、木聚糖含量测定 精确称取0.3 g预处理样品(未处理样品用苯醇进行索式抽提，以去除树脂、色素等)于100 mL旋盖烧口瓶中，加入3 mL 72% H2SO4，混合均匀后在(30±3) ℃水浴中保温1 h，期间每隔10 min震荡摇匀1次。向瓶中加入84 mL蒸馏水，即将H2SO4溶液浓度稀释至4%，拧紧瓶盖后置于高压灭菌锅内121 ℃水解1 h。水解完成后用已称质量的G3砂芯漏斗真空抽滤，分离残渣和水解液。一部分水解液用于测定酸溶木质素，另一部分用CaCO3中和至中性，采用高效液相色谱(HPLC，HITACHI L-2000)分析葡萄糖、木糖含量，分析柱为Bio-Rad Aminex HPX-87P，300 mm×7.8 mm(长×直径)，保护柱为Cation-H Refill Cartridges，30 mm×4.6 mm(长×直径)，检测器为RID示差折光检测器。进样量20 μL，流动相为0.005 mmol·L-1的H2SO4，流速0.5 mL·min-1，柱温45 ℃。仪器检测结果为水解液单糖含量，六碳糖乘以0.9、五碳糖乘以0.88即可换算出样品中纤维素和木聚糖含量。

1.3.2 木质素含量测定 木质素包括酸溶木质素和酸不溶木质素2部分。酸不溶木质素测定采用称量法，称取样本1 g，用72% H2SO4处理1 h后，固液分离，固体部分即为酸不溶木质素和灰分。固体部分在(103±2) ℃下干燥后称质量，得到酸不溶残渣的总质量。采用智能干燥箱将固体残渣在575 ℃下连续加热4 h，称量，得到灰分含量，酸不溶残渣与灰分质量之差即为酸不溶木质素含量。

酸溶木质素测定采用紫外光谱法(UV法)，首先制备氯化锂/二甲基亚砜(LiCl/DMSO)溶剂，DMSO溶液中加入8%烘干的LiCl，常温连续磁化搅拌，将1.0%的原料溶解在LiCl/DMSO溶剂中搅拌5天后，倒入紫外线石英比色皿中(尺寸45 mm×12.5 mm×12.5 mm)，在400～800 nm范围内，通过紫外分光光度计(吸收值)测量酸溶木质素含量。

酸溶木质素含量(ASL)采用下式计算：

(1)

式中：N为稀释倍数；A为紫外吸收值(240 nm)；V为滤液吸收总体积；W为酸解前样品绝干质量。

1.4 FTIR红外光谱图像采集

红外光谱分析采用尼高力红外光谱仪(Nicolet FTIR IS10)，测试波长范围400～4 000 cm-1，光谱分辨率32 cm-1，扫描次数64次，使用压片法进行测定。

1.5 结晶区主要参数计算

由木材纤维波谱学特征可知，002峰和040峰反映的是纤维素结晶区的长度和宽度。大多数情况下，040峰不明显，所以本研究采用002峰的衍射强度和位置计算结晶区的变化情况。利用Segal(1959)公式计算：

(2)

式中：CrI为相对结晶度(%)；I002为002 晶格衍射角(2θ)的极大强度；Iam为非结晶散射强度。

2 结果与分析

2.1 预处理前后原料的主要化学组分分析

通过NREL方法测定原料预处理前后化学组成，可得出原料中纤维素、木聚糖、木质素的含量变化。由表2可知，经乙醇钠预处理后，3种原料的纤维素、木聚糖含量均有所增加，纤维素含量增加幅度较木聚糖大，而木质素含量则相对减少。纤维素含量增加幅度最大的是预处理杉木，增加量为7.6%，其次是预处理松木，增加量为5.9%，最差的是水曲柳，增加幅度仅为3.4%，这可能是因为3种木材的软硬材质等不同导致的，杉木材质最软，松木次之，水曲柳最为坚硬。此外，3种原料的木聚糖含量均有所增加，但增加幅度不大。

2.2 预处理前后原料的红外光谱特征及分析

松木、杉木和水曲柳作为生物质原料，主要化学组分中三大素经乙醇钠预处理后，成分含量会发生一些变化，因此在红外光谱上会出现一些吸收改变。将乙醇钠预处理后各材料红外吸收峰的细微变化与未处理材料进行比对，分析化学成分官能团结构的变化，结果见表3。

表2 乙醇钠预处理前后原料化学组分Tab.2 Main chemical component measurements by C2H5 ONa pretreatment conditions %

表3 红外光谱的特征峰及归属Tab.3 Functional groups absorption band of infrared spectra of cellulose

图1 预处理前后水曲柳傅里叶变换红外光谱Fig.1 Infrared spectra of pretreated and native F.mandschurica

处是苯环骨架结合C—H在平面变形伸缩振动；1 372 cm-1处属于脂肪族在甲基中和酚羟基上的C—H伸缩振动；1 249 cm-1处是木质素酚醚键C—O—C伸缩振动；1 049 cm-1处是在仲醇和脂肪醚中的C—O变形(秦特夫等，2010)。

纤维素的特征吸收峰2 921和3 412 cm-1处(黄安民等，2007)，乙醇钠处理和未处理水曲柳得到的光谱变化明显，表明纤维素含量发生变化，乙醇钠预处理水曲柳纤维素含量增加，与组分分析结果一致。

乙醇钠预处理前后杉木在1 048 cm-1处出现羟基的O—H伸缩振动，说明纤维素含量有所变化，通过对比分析得出，乙醇钠预处理杉木纤维素含量明显增多，与组分中纤维素含量增多一致。1 636 cm-1附近的吸收峰在乙醇钠预处理后光谱变缓，木质素含量呈减少趋势。

图3 预处理前后松木傅里叶变换红外光谱Fig.3 Infrared spectra of pretreated and native Pinus

木质素结构中含有众多复杂的官能团，1 636 cm-1和1 420 cm-1附近，处理与未处理的波段变化趋势不是十分明显，说明乙醇钠预处理对松木的木质素脱除效果并不十分理想。纤维素的特征吸收峰3 408 cm-1处，处理与未处理原料得到的光谱有一定差异，乙醇钠预处理的松木纤维素含量增加。

2.3 预处理前后原料的纤维素结晶度分析

针对6组不同检测样本，通过XRD 扫描处理后，可得到明显的002峰位置及其衍射强度变化，如图4所示。

由图4可以看出，101、002和 040峰衍射角分别为16.02°、22.50°和34.76° 左右，这是典型的纤维素Ⅰ的特征。2θ的变化范围从21.26°到 22.86°，反映出经过预处理后002晶面衍射峰位置发生显著变化。曲线e峰形尖锐程度较大，说明经过预处理后结晶区晶胞参数变小，晶面间距变小，预处理后材料结晶间距变小对于提高材料的尺寸稳定性有很强的参考利用价值。该结果与以往研究具有一致性(Nishimiyaetal.，1998)。

图4 预处理前后样品002峰位置变化及其衍射强度变化Fig.4 Changes of 002 peak position and diffraction intensity of samples before and after pretreatment

根据002晶面结晶指数式(2)得出结晶参数变化情况，如表4所示。

较低的结晶度指数CrI表明在总体样品中存在较高比例的纤维素无定型物质，如半纤维素和木质素等。由表4可以看出，经过一定的预处理过程，移除了部分非结晶物质，使得纤维素含量比例相对增加。预处理杉木的相对结晶度高于松木和水曲柳，说明预处理后杉木的纤维素含量比例增加最大，松木和水曲柳次之。

表4 预处理前后样品的结晶度变化Tab.4 Changes in crystallinity of pretreated and native material

基于以往研究中红外光谱吸收带的峰强比，1 428 cm-1和896 cm-1峰强之比，3 338 cm-1和1 336 cm-1峰强之比，计算结晶度指数(LOI)和氢键强度指数HBI(Nishimiyaetal.，1998)。一般来说，LOI变化反映晶体区域和非晶态区域量的变化，HBI变化反映纤维素内部结晶变化。乙醇钠预处理后样品的LOI相对于对照样均有所提高，说明乙醇钠预处理提高了木质纤维素原料的相对结晶度，与相关学者研究结果一致(Yangetal.，2010)。

结晶度变化的原因在于，经过碱处理后，细胞壁的吸附力增强，细胞壁结晶区表面纤维素分子链中的低聚糖被溶出，且无定型区的活性基团裸露，半纤维素与弱碱发生剥皮反应，导致结晶度变化，与Tamura 等(2003)的研究结果一致。

2.4预处理前后原料的酶解特性

为了进一步验证预处理效果，分别采用10、20、30 fpu CTEC2 二代酶作为3种浓度梯度对比葡萄糖和木聚糖水解得率变化情况。由图5可知：1) 水解处理后预处理原料的纤维素、木聚糖含量存在不同水平的变动，10、20、30 fpu的二代酶都能在72 h很好地酶解预处理原料；2) 3种浓度的二代酶都能达到酶解预处理原料的目的，30 fpu的二代酶处理对预处理原料的效果最好。此外，在30 fpu二代酶解条件下选用48 h和72 h作为酶水解的时间点，分析原料纤维素和木聚糖得率变化情况(图6)，葡萄糖和木聚糖的水解得率由大到小依次为预处理杉木>预处理松木>预处理水曲柳。

图5 酶梯度对比葡萄糖和木聚糖水解得率变化Fig.5 72 h，10,20,30 fpu CTEC2 two generation enzyme treatment raw materials glucose and xylan yield histogramA.10 fpu葡萄糖Glucose(10 fpu);B.20 fpu葡萄糖Glucose(20 fpu);C.30 fpu葡萄糖Glucose(30 fpu);D.10 fpu木聚糖Xylan(10 fpu);E.20 fpu木聚糖Xylan(20 fpu);F.30 fpu木聚糖Xylan(30 fpu).

图6 时间点对比二代酶处理原料葡萄糖和木聚糖得率变化Fig.6 Histogram of yield change of glucose and xylan from raw materials treated by 48 h and 72 h 30 fpu two generation enzymesA.72 h木聚糖Xylan(72 h)；B.48 h木聚糖Xylan(48 h)；C.72 h葡萄糖Glucose(72 h)；D.48 h葡萄糖Glucose(48 h).

3 讨论

乙醇钠作为一种典型的醇盐，具强碱性。乙醇钠水解生成氢氧化钠和乙醇(C2H5ONa + H2O → C2H5OH + NaOH)，经乙醇钠预处理后，松木、杉木、水曲柳的三大素含量均有不同程度变化，其中乙醇钠预处理杉木纤维素含量提高最多，松木次之，水曲柳较低；从除木质素效果看，松木的预处理效果较好，木质素含量相对降低6.1%，针叶材的乙醇钠预处理体系处理效果较好。本结果与以往研究结论(Talebniaetal.，2010)一致，可为后续学者进行乙醇钠相关预处理研究提供理论依据。

4 结论

1) 经过一定预处理过程，移除了部分非结晶物质，使得纤维素含量比例相对增加。预处理杉木的相对结晶度高于松木和水曲柳，说明预处理后杉木的纤维素含量比例增加最大，松木和水曲柳次之。

2) 水解处理后预处理原料的纤维素、木聚糖含量都有不同水平的变动，10、20、30 fpu的二代酶都能在72 h很好地酶解预处理原料。3种含量的二代酶效果都达到酶解预处理原料的目的，但是30 fpu的二代酶处理对预处理原料的效果最好。在30 fpu二代酶解条件下选用48 h和72 h作为酶水解的时间点变化，葡萄糖和木聚糖的水解得率由大到小依次为预处理杉木>预处理松木>预处理水曲柳。