汉防己甲素对卵蛋白诱导大鼠哮喘模型的抗氧化保护作用

林益平 吴美玲 魏艳丽 应晓倩 裘颖儿 潘晓明 丁明星 唐红娟 翁美贞

哮喘是一种常见的由多种细胞及细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，具有可变气道阻塞和支气管高反应性。临床上，哮喘患者会反复出现喘息、咳嗽、胸闷和呼吸急促等症状[1]。慢性炎症一直是该疾病的研究热点，而近年来，有研究发现治疗顽固性哮喘的无效性与氧化应激有关，提示抗氧化在哮喘治疗中具有重要意义[2]。核因子-E2相关因子（Nrf2）是一种氧化还原敏感转录因子，是氧化应激和环境应激反应的关键调节因子。Nrf2缺陷小鼠对哮喘的易感性增加，包括氧化应激、炎症、黏液和气道高反应性（AHR），Nrf2的特异性激活可以显著降低过敏原诱导的气道高反应性及炎症反应，抑制辅助性T淋巴细胞2（Th2）类细胞因子分泌，降低氧化应激反应和减轻气道渗漏，增强上皮屏障功能[3-4]。汉防己甲素（Tet）主要从防己科千金藤属植物粉防己块茎中提取，是一种钙通道阻滞剂，临床试验发现它对硅沉着病、高血压、炎症和肺癌有效，且毒性较小。Tet的药理作用主要表现在抗氧化、增强细胞自噬、逆转多药耐药和钙通道修饰等方面[5-6]。Tet不良反应小，低浓度即具有较好的抗氧化作用，具有良好的应用前景，但相关机制研究非常少。本研究拟建立卵蛋白（OVA）诱导大鼠哮喘模型，探讨Tet对哮喘的治疗效果及抗氧化机制，为Tet的临床应用提供更多理论依据。

1 材料和方法

1.1 动物、试剂及仪器 30只雄性SD大鼠，体重（200±20）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。Tet购自浙江华润三九众益制药有限公司；谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒（A061-1，48T）和 γ-谷氨酰半胱氨全成酶（γ-GCS）试剂盒（A091-1，100管/48样）均购自南京建成生物工程研究所；SYBR Green PCR试剂盒购自美国 Thermo Fisher Scientific公司（4309155，1×5ml）；逆转录试剂盒购自美国MBI Fermentas公司（K1621，10次）；大鼠半胱氨酰白三烯（CysLT1）ELISA kit购自美国R&D Systems公司（RDC0341，96T）；大鼠半胱氨酰白三烯受体（CysLTR1）ELISA kit购自武汉华美生物工程有限公司（CSB-EL006465RA，96T）；平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（ab32575，40μl）、Nfr2 抗体（ab137550，50μl）与山羊抗兔单克隆抗体（ab205718，500μg）均购自英国Abcam公司。光学显微镜（日本尼康公司，D5100）；酶标仪（美国Thermo Scientific公司，MULTISKAN MK3）；实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司，StepOne TM）。

1.2 模型建立及分组给药 30只SD大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组和Tet治疗组各10只。模型组和Tet治疗组 1次/2d雾化吸入 1mg/ml OVA溶液30min，共8周。按照文献[7]方法造模成功后，哮喘大鼠出现挠鼻，打喷嚏，喘息症状。Tet治疗组用100mg/kg Tet灌胃处理，1次/d，共8周，对照组和模型组予等量0.9%氯化钠溶液灌胃处理，1次/d，共8周。实验结束后用1%戊巴比妥钠麻醉后处死大鼠，剖开各组大鼠胸腔，取出肺脏，用预冷的0.9%氯化钠溶液清洗。用于病理检测的肺脏样本在4%多聚甲醛中保存，其他实验所需的样本在液氮中保存备用。

1.3 肺组织病理切片检查 肺组织经4%多聚甲醛固定，用乙醇梯度脱水、包埋、切片至4μm，采用HE染色、脱水、中性树胶封片。光学显微镜下拍照（200倍），观察肺组织气道壁和气管周围炎性细胞情况。

1.4 肺组织CysLT1和CysLTR1含量的检测 采用ELISA法。称取肺样本（100mg）并在1ml含有蛋白酶抑制剂的组织蛋白提取试剂中匀浆，2 500r/min，低温离心机（Eppendorf，5702R）离心 20min，获得上清液。按照ELISA检测试剂盒方法，在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl，温育、洗涤、加酶，再次温育和洗涤后显色，加终止液终止反应，空白调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），以OD值为纵坐标，标准品（即已知确切浓度的标准物品，作为含量测定中的标准含量）为横坐标，得标准曲线，再将样品OD值代入，从而测定肺组织CysLT1和CysLTR1含量。

1.5 肺组织氧化应激相关指标的测定 采用分光光度法。大鼠肺组织称重剪碎，在0.1M Tris-HCl（pH7.4）缓冲液中制备匀浆液，2 500r/min，低温离心10min，取上清液待测。按照γ-GCS、氧化型谷胱甘肽（GSSG）及GSH等试剂盒说明书，于酶标仪中分别测定每个指标含量。根据GSH和GSSG检测结果，计算GSH/GSSG比值，比率下降情况反映脂质过氧化损伤情况。

1.6 肺组织Nrf2、血红素加氧酶-1（HO-1）、转化生长因子（TGF-β1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）的 mRNA表达水平测定 采用qRT-PCR法。取大鼠肺组织，剪碎加入1ml TrizolTM试剂提取肺组织RNA，按照反转录试剂盒说明，将RNA反转录成cDNA，取cDNA产物2μl，加入SYBR Green Mix 12μl、上游引物和下游引物（见表1）各0.5μl，并加入双蒸水（ddH2O），体系总体积为 20μl，进行q-PCR扩增。反应程序：95℃ 5min，1个循环；95℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 30s，40 个循环；95℃ 15s，58℃ 15s，1 个循环。读取各个扩增反应的Ct值，利用2-ΔΔCt法计算Nrf2、HO-1、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1 的 mRNA 表达水平。

表1 各qPCR引物序列

1.7 肺组织α-SMA和Nrf2蛋白表达情况检测 采用免疫荧光染色法。将玻片在60°C的培养箱中干燥40min，二甲苯中脱蜡，乙醇梯度脱水。切片浸泡在0.3%柠檬酸盐缓冲液中，微波炉加热。再用3%过氧化氢去离子水处理，加 α-SMA（1∶200）和 Nrf2（1∶100）一抗，4°C过夜。加二抗37°C孵育 30min，PBS清洗 2次，二氨基联苯胺显色，苏木精复染。DAPI染色细胞核，覆盖住样品，室温放置5～10min，0.9%氯化钠溶液洗2～3次，每次3～5min，洗去DAPI。中性胶封片，用光学显微镜检查。

1.8 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠肺组织病理检查结果比较 对照组大鼠肺组织结构正常，而模型组大鼠肺组织气道壁增厚，并且气管周围可见炎细胞聚集；而Tet治疗组较模型组肺组织气道壁厚度减轻，并且炎细胞浸润情况有所缓解，见图 1（插页）。

2.2 3组大鼠肺组织CysLT1和CysLTR1含量比较与对照组相比，模型组CysLT1和CysLTR1含量均明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；而与模型组比较，Tet治疗组肺组织CysLT1和CysLTR1含量明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表2。

表2 3组大鼠肺组织CysLT1与CysLTR1含量比较（mg/g）

2.3 3组大鼠肺组织氧化应激相关指标比较 与对照组相比，模型组肺组织γ-GCS活性明显增加，GSH含量明显下降，GSSG含量明显增加，GSH/GSSG比值降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；与模型组相比，Tet治疗组肺组织γ-GCS活性明显降低，GSH含量明显增加，GSSG含量明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表 3。

表3 3组大鼠肺组织氧化应激相关指标比较

2.4 3 组大鼠肺组织 Nrf2、HO-1、TGF-β1、MMP-9 和TIMP-1 mRNA表达水平比较 与对照组相比，模型组肺组织 Nrf2、HO-1、TGF-β1、MMP-9 表达水平均明显增加，TIMP-1 mRNA表达水平明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；与模型组比较，Tet治疗组肺组织Nrf2、HO-1、TIMP-1 mRNA 表达水平明显增加，TGF-β1、MMP-9 mRNA表达水平明显降低，差异均有统计学意义（均 P＜0.01），见表 4。

2.5 3组大鼠肺组织α-SMA和Nrf2免疫荧光染色结果比较 对照组大鼠肺组织α-SMA和Nrf2荧光呈现弱阳性，而模型组大鼠肺组织α-SMA和Nrf2的荧光呈强阳性表达；而Tet治疗组较模型组肺组织α-SMA荧光强度有所减弱，Nrf2荧光强度增强，见图2（插页）。

3 讨论

哮喘是一种常见的呼吸道慢性炎症性疾病，影响着全世界数百万人。几十年来，一直使用支气管扩张剂和皮质类固醇治疗哮喘，如吸入型糖皮质激素，但对哮喘气道重塑影响不大，且治疗不良反应较大。因此，近年来研究员致力于开发新的治疗药物。有研究发现糖皮质激素受体激动剂对糖皮质激素受体有选择性作用，可显著减少药物不良反应[8]。一些单克隆抗体如Dupilumab阻断白细胞介素4（IL-4）和IL-13的信号传导，可作为青少年和成人中重度哮喘的辅助治疗，取得较好的效果[9]，但价格昂贵。用我国传统中药哮喘防治是一个新的思路，具有较大潜力，也愈来愈被国家和科研工作者重视。如平喘宁汤通过磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶点（MTOR）信号通路抑制自噬现象而治疗哮喘[10]，温通汤促进嗜酸细胞凋亡从而治疗哮喘[11]。Tet在中国药典中被广泛引用，可用于治疗高血压、哮喘、肺结核、痢疾和癌症等疾病，但其在哮喘治疗中的作用机制依旧不明。

表4 3组大鼠肺组织Nrf2、HO-1、TGF-β1、MMP-9和TIMP-1 mRNA表达水平比较

目前抗哮喘机制的研究重点是阻止气道炎症反应和缓解气道重塑。本研究成功构建了大鼠哮喘气道重塑模型，各实验组肺组织病理学变化结果显示，Tet能抑制炎细胞浸润，减轻气道壁厚度，说明大鼠哮喘模型构建成功，且Tet具有较好的治疗作用。CysLTs是由5-脂氧合酶途径形成的促炎介质，可诱发支气管收缩、微血管渗漏、黏液分泌和气道炎症细胞募集增多，与多种类型的哮喘有关[12]。本研究发现，模型组CysLT1和CysLTR1含量显著增加，Tet治疗显著降低肺组织CysLT1和CysLTR1含量。α-SMA和TGF-β1均是气道重塑的关键因子，参与血管和纤维生成，在慢性肺部疾病如哮喘中高表达[13-14]。MMPs可以分解细胞外基质，其中MMP-9与气道壁胶原沉积相关性最强，导致气道重塑[15]。TIMPs是MMPs特异性抑制因子，能抑制气道重塑。本研究显示，模型组高表达α-SMA、TGF-β1、MMP-9，低表达 TIMP-1。Tet能抑制 α-SMA、TGF-β1、MMP-9表达，增加TIMP-1表达。上述结果提示Tet通过抑制哮喘大鼠气道重塑和炎症，显示出良好的抗哮喘效果。

关于导致气道炎症和气道重塑机制，近年来人们逐渐认识到氧化应激可能起到重要作用。氧化与抗氧化之间的不平衡会导致细胞损伤，被称为氧化应激。肺部持续地暴露在各种不同类型和程度的氧化剂中，导致嗜酸性粒细胞和中性粒细胞积累而促进了哮喘的发生[16]。GSH是人类和其他哺乳动物含有的一种主要非蛋白硫醇，GSH及其相关酶既能防止氧化损伤，又能解毒，是肺内最主要的抗氧化物质。在氧化应激下，两个GSH分子通过二硫化物桥连接形成GSSG[17]。因此，评估GSH/GSSG比值可以评估细胞氧化还原代谢情况。γ-GCS为合成GSH的限速酶。OVA诱导的小鼠体内GSSG升高，GSH/GSSG比值下降，研究发现山茱萸能降低GSSG水平，升高GSH/GSSG比值[18]。补充硫化氢（H2S）或抑制一氧化氮合酶（iNOS）导致GSH/GSSG比值增加，保护气道免受氧化应激，可治疗炎症性肺病[19]。本研究发现模型组肺组织GSH含量下降，GSSG含量增加，GSH/GSSG比值显著降低，而γ-GCS活性增加，可能是哮喘发作过程导致氧化剂增加，GSH被过度消耗，反馈性使γ-GCS合成增加所致。经过Tet治疗后，肺组织GSH含量增加，GSSG含量降低，GSH/GSSG比值显著增加，随之γ-GCS也反馈性合成减少，提示Tet是通过抗氧化作用而发挥抗哮喘。

γ-GCS的合成是受转录因子Nrf2调控[20]，同时Nrf2也可以调节抗氧化因子HO-1的转录。研究显示，有机粉尘会导致肺部炎症、气道高反应性和氧化应激。此过程Nrf2依赖基因和Nrf2核易位的mRNA表达水平增加[21]。本研究发现，模型组肺组织Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表达均显著增加，经过Tet治疗后，肺组织Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表达进一步增强，笔者推测氧化应激条件下，机体自身可能发生了适应性反应，药物治疗进一步增强了机体抗氧化能力。

综上所述，哮喘发作存在氧化应激现象，Tet对哮喘大鼠肺组织具有保护作用。其治疗机制可能为通过激活Nrf2/HO-1途径下调氧化应激水平，同时减少CysLT1和CysLTR1的含量而减轻炎症，进而抑制α-SMA、TGF-β1、MMP-9 的表达，增加 TIMP-1 的表达，缓解气道重塑。

图1 3组大鼠肺组织病理检查所见（HE染色，×200）

图2 3组大鼠肺组织α-SMA和Nrf2蛋白免疫荧光检测所见