血清外泌体miR-184在甲状腺乳头状癌中的表达及其诊断效能

任 莹，何 喻，丛玲华

(宁波市鄞州人民医院 病理科，浙江 宁波 315000)

图1 血清外泌体miR-184的相对表达量分析

图2 血清外泌体miR-184诊断甲状腺乳头状癌的ROC曲线图

甲状腺乳头状癌为甲状腺癌常见的一种组织学分型，临床治疗以手术切除为主，患者一般预后良好，但对于出现被膜侵犯或淋巴结转移者，预后较差[1]。因此，探寻甲状腺乳头状癌早期诊疗生物学标记物尤为重要。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类非编码小RNA，长度约为20～23个核苷酸，其参与肿瘤的发生发展[2]。miRNA通过外泌体介导在机体循环系统中稳定运转，由于不同肿瘤中miRNA表达不同，且具有较高的特异性，推测外泌体miRNA亦可作为肿瘤生物学标记物[3]。因此，本研究对比分析了甲状腺乳头状癌患者、结节性甲状腺肿患者及体检健康者血清外泌体中miR-184的表达，探讨其诊断甲状腺乳头状癌的临床价值，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 对象 2017年3月—2019年3月我院收治的甲状腺乳头状癌患者410例，均经手术病理确诊，排除合并其他恶性肿瘤者及严重心肝肾功能不全者。其中男性187例，女性223例；年龄19～57岁，平均(41.93±3.07)岁。另选取同期就诊的结节性甲状腺肿患者100例、体检健康者100例作为对照。结节性甲状腺肿组：男性44例，女性56例；年龄21～62岁，平均(42.77±2.95)岁。体检健康组：男性39例，女性61例；年龄17～59岁，平均(40.86±2.54)岁。3组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获医院伦理学委员会审批，入组对象均知情同意。

1.2 血清外泌体miR-184检测

1.2.1 标本采集 采集3组空腹静脉血5～8 mL，甲状腺乳头状癌组和结节性甲状腺肿组患者于术前采集，对照组于体检当日采集，经离心处理后取上清液存于-80 ℃冰箱中备检，整个过程避免溶血。

1.2.2 检测方法 按照ExoQuick-TM试剂盒(生产厂家：美国SBI公司)操作说明提取血清外泌体样品，经染色后置于日本电子公司生产的tem-100cxⅡ型透射电子显微镜下观察颗粒形态，采用Western Blot检测外泌体表面蛋白标志物，采用Nanosight检测外泌体颗粒浓度。应用美国Invitrogen公司生产的Trizol试剂将外泌体样品进行裂解，将提取的外泌体中总RNA经纯化后行逆转录，采用Sybr Green法检测外泌体中miR-184，应用相对定量法计算外泌体中miR-184的相对表达量，根据公式2-ΔCt值= 2-ΔCt值(miR-184)- 2-ΔCt值(miR-39)，miR-39为外参基因。

2 结果

2.1 各组血清外泌体miR-184的相对表达量比较 经电镜观察、Nanosight及Western Blot检测，发现纯化的样品中含有大量外泌体颗粒，与已往文献报道的外泌体特征相符。本研究显示，甲状腺乳头状癌组、结节性甲状腺肿组及体检健康组患者血清外泌体miR-184的相对表达量分别为(1.24±0.37)、(0.91±0.19)、(0.68±0.22)，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)，其中，甲状腺乳头状癌患者血清中的外泌体miR-184表达量最高。见图1。

2.2 ROC曲线分析 以血清外泌体miR-184的相对表达量作检验变量，以是否形成甲状腺乳头状癌为状态变量作ROC曲线。结果显示，血清外泌体miR-184诊断甲状腺乳头状癌的敏感性为91.70%，特异性为82.45%，约登指数为0.748，其曲线下面积为0.829(95%CI：0.704～1.032)，见图2。

3 讨论

miRNA为近年发现的一类内源性小RNA，主要以单拷贝、多拷贝或基因簇等形式存在，其在动植物中参与转录后调控基因表达[4]。近年来，随着分子生物学机制的深入研究，发现 miRNA与多种肿瘤的发生进展存在相关性[5]。miR-184为miRNA家族重要的成员之一，既往研究显示，miR-184在肾癌[6]、人脑胶质瘤[7]等肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。但此类研究大多基于肿瘤组织，收集miRNA检测样本时需行有创手术或活检穿刺，不便于临床对于甲状腺乳头状癌的筛查。有资料显示，外周血miRNA可作为肿瘤诊断标记物，且样本采集方式简单无创。郭辉等[8]研究报道，甲状腺乳头状癌患者血清中miR-214的表达高于良性甲状腺肿瘤患者，提示血清miRNA可作为甲状腺乳头状癌的诊断标记物。

最近有学者提出，miRNA可稳定存在于血清外泌体内，采用血清外泌体miRNA作为肿瘤诊断标记物更加可靠，可避免因血清成分复杂而影响miRNA检测结果[9]。本研究结果显示，甲状腺乳头状癌患者血清中外泌体miR-184的相对表达量显著高于结节性甲状腺肿者及体检健康者。提示，高表达的miR-184可能与甲状腺乳头状癌的发生存在一定关系。进一步采用ROC曲线分析血清外泌体miR-184诊断甲状腺乳头状癌的临床价值，发现血清外泌体miR-184诊断甲状腺乳头状癌的敏感性为91.70%，特异性为82.45%，约登指数为0.748，其曲线下面积为0.829(95%CI：0.704～1.032)。提示，血清外泌体miR-184对甲状腺乳头状癌诊断

效能较高。颜晓慧等[10]对94例肺癌患者进行研究，发现血清外泌体miR-21诊断效能较高，有望成为肺癌早期诊断标志物。张云等[11]对82例原发性肝癌患者进行研究，发现血清外泌体miRNA-122可用于原发性肝癌的早期临床诊断。以上研究表明，血清外泌体miRNA与多种恶性肿瘤存在相关性，有望成为临床恶性肿瘤诊断的生物学标志物。

综上所述，甲状腺乳头状癌患者血清外泌体中miR-184呈高表达，其诊断敏感性及特异性较高，或将成为甲状腺乳头状癌的临床诊断生物学标志物。