利多卡因对脂多糖诱导大鼠急性肺损伤的影响及机制

刘瑞莲，姚雯菲，许立新

广州医科大学附属广州市第一人民医院，广州510180

急性肺损伤(ALI)更严重的形式为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。ALI/ARDS已经成为重症监护室患者发病和病死最主要的原因，是脓毒症最常见的并发症，其机制与治疗方案是当前迫切希望解决的难题。利多卡因的抗炎作用已经获得广泛的认可，其机制可能与阻滞神经轴突上的离子通道有关，ATP门控的嘌呤能P2X7受体(P2X7R)主要表达在免疫细胞中，并且在已知的一些炎症反应中起着至关重要的作用，可以诱导白细胞介素-1β(IL-1β)的成熟和释放，并且启动炎症级联反应[1, 2]。研究表明,利多卡因与P2X7R均参与多种炎症反应过程，但关于两者之间的关系研究甚少。那么利多卡因是否通过抑制ATP门控的离子通道来抑制P2X7R的表达，从而降低炎症反应还需进一步研究。2017年3～11月，我们观察了利多卡因对ALI模型大鼠肺损伤程度及P2X7R/炎症小体NLRP3/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(P2X7R/NLRP3/Caspase-1)轴表达的变化，探讨利多卡因对ALI的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 SPF级雄性SD大鼠40只(购自广东省医学实验动物中心)，体质量180～220 g，自由饮食，昼夜节律饲养。脂多糖(LPS)粉剂(L2880，Sigama公司，美国)；2%利多卡因、戊巴比妥钠(Sigama公司，美国)；P2X7R兔多克隆抗体(AB5246，Millipore公司，美国)；NLRP3兔单克隆抗体(ab210491，Abcam公司，美国)；Caspase-1兔单克隆抗体(ab108362，Abcam公司，美国)；GAPDH(GB13002，武汉谷歌生物科技，中国)；HRP标记山羊抗兔(GB23303，武汉谷歌生物科技，中国)；HRP标记驴抗山羊(GB23404，武汉谷歌生物科技，中国)；IL-1β、HMGB1 ELISA试剂盒(SEA563Ra，SEA399Ra，武汉优尔生商贸有限公司，中国)；MPO试剂盒(A044，南京建成生物工程研究所，中国)。酶标检测仪(Epoch，BioTeK，美国)；全自动生化分析仪(Chemray 240，深圳雷杜生命科技，中国)；扫描仪(EPSON，V300，日本)；电泳槽和转膜槽(BIO-RAD 公司，美国)；显微镜(Nikon公司，日本)。

1.2 动物分组 采用随机数字表法将40只雄性SD大鼠随机分成5组：生理盐水对照组(NS组)、脂多糖(LPS)模型组(LPS组)、5 mg/kg利多卡因治疗组(5LD组)、10 mg/kg利多卡因治疗组(10LD组)、20 mg/kg利多卡因治疗组(20LD组)，每组8只。

1.3 模型制备及干预方法 实验前所有大鼠禁食12 h，自由饮水。腹腔注射5 mg/kg LPS建立ALI模型，以LPS组中LPS给药时间为基点，三个利多卡因治疗组分别于LPS注射前10 min、LPS注射后1 h、LPS注射后3 h三个时间点腹腔注射相应剂量1%利多卡因，LPS组在这三个时间点给予等量生理盐水，NS组四个时间点给予等量的生理盐水。

1.4 实验标本的处理 建模24 h后，腹腔注射2%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉大鼠，固定于大鼠解剖板，开胸暴露心脏，寻找右心室，左心耳，用50 mL注射器将50 mL预冷的磷酸盐缓冲液PBS缓慢从右心室灌注，剪开左心耳放血，至肺变白。灌注完毕，结扎左侧肺支气管，快速取下肺组织至预冷的PBS中漂洗，右肺上、中、下叶在预冷的PBS液中分别剪成200 mg左右大小，再次放入预冷的PBS中漂洗，用滤纸吸干表面水分于液氮中速冻后放至-80 ℃冰箱保存，用于Western blotting、Elisa、MPO检测。

1.5 检测指标

1.5.1 肺组织病理学 采用HE染色法，左上肺组织在预冷的PBS中剪成1 cm×1 cm×1 cm大小，用滤纸吸干表面水分放入4%多聚甲醛固定48 h，制成厚5 μm的石蜡切片，行HE染色，显微镜下观察肺组织病理变化。

1.5.2 肺湿干重比值(W/D) 左下肺组织用滤纸吸干表面水分称重(湿重W)，用等面积锡纸包裹后置于72 ℃烤箱48～72 h，至衡重后称重(干重D)，计算W/D。

1.5.3 P2X7R、NLRP3、Casepase-1 蛋白表达 采用Western blotting法检测。取右肺组织剪成200 mg左右大小，于液氮中速冻后放至-80 ℃冰箱保存，解冻后加入10倍组织体积本试剂冰上彻底匀浆，离心收集上清，采用BCA法测蛋白浓度。取60 μg总蛋白于10%分离胶和5%的浓缩胶中进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离的目的蛋白转移至PVDF膜上，于含5% BSA封闭液中室温1 h。加入适量按比例稀释的特异性一抗(P2X7R比例1∶250，NLRP3与Casepase-1比例1∶1 000)，然后添加HRP标记的二抗(1∶3 000)。最后添加适量ECL发光试剂盒中的AB混合液，根据不同的光强度调整曝光条件。以AlphaEase FC软件取条带灰度值。以目的蛋白条带的灰度值与内参GAPDH条带灰度值比值来计算该蛋白的表达量。

1.5.4 肺组织IL-1β、HMGB1水平 采用ELISA法检测。检测严格按照ELISA试剂盒进行，在酶标仪上，于450 nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。根据标准品的浓度和OD值做标准曲线，然后根据标准曲线方程计算出样本浓度。

1.5.5 肺组织MPO含量 采用比色法检测。检测严格按照MPO试剂盒进行，全自动生化分析检测指标结果是仪器自动生成样本浓度，根据试剂盒公式计算MPO活力(U/克组织湿重)=(测定OD值-对照OD值)/11.3×取样量。

2 结果

2.1 肺组织病理学观察 NS组肺组织结构完整，肺泡间隔无水肿扩张，无炎症渗出，肺泡腔清晰；LPS组肺组织结构明显受损，肺泡毛细血管扩张，肺泡腔红细胞渗出，肺泡间隔水肿、大量炎症细胞浸润、出血；20LD组肺泡结构基本完整，肺泡间隔水肿、炎症细胞浸润、出血均明显减轻；10LD组减轻程度不如20LD组，5LD组减轻程度则不明显。见图1。

注：A、B、C、D、E分别代表NS组、LPS组、5LD组、10LD组、20LD组。

图1 大鼠肺组织病理学表现(HE染色法，200×)

2.2 各组肺组织W/D比较 NS组、LPS组、5LD组、10LD组、20LD组W/D分别为1.680±0.126、2.181±0.046、2.062±0.110、1.920±0.030、1.792±0.116。LPS组W/D高于NS组，10LD组、20LD组W/D均低于LPS组(P均<0.01)。

2.3 各组肺组织P2X7R、NLRP3及Caspase-1蛋白表达比较 LPS组P2X7R、NLRP3、Caspase-1蛋白表达均高于NS组(P均<0.01)；10LD组P2X7R、NLRP3蛋白表达均低于LPS组(P均<0.05)；20LD组P2X7R、NLRP3、Caspase-1蛋白表达均低于LPS组(P均<0.05)。见表1、图2。

组别P2X7R/GAPDHNLRP3/GAPDHCaspase-1/GAPDHNS组0.070 00±0.050 000.063 30±0.051 320.040 00±0.177 32LPS组0.930 00±0.265 80△0.556 70±0.125 80△0.856 70±0.277 90△5LD组0.730 00±0.173 500.370 00±0.134 500.660 00±0.280 0010LD组0.580 00±0.150 00∗0.216 70±0.113 70#0.500 00±0.190 0020LD组0.296 70±0.032 15#0.103 30±0.058 59#0.246 70±0.204 30∗

注：与NS组比较，*P<0.05,△P<0.01;与LPS组比较，#P<0.01。

图2 各组肺组织P2X7R、NLRP3及Caspase-1蛋白表达情况(Western blotting法)

2.4 各组肺组织IL-1β、HMGB1水平及MPO活力比较 LPS组IL-1β、HMGB1、MPO水平均高于NS组(P<0.01)；5LD组、10LD组、20LD组IL-1β、HMGB1、MPO水平均低于LPS组(P<0.05或0.01)。见表2。

组别IL-1β(pg/mL)HMGB1(pg/mL) MPO活力(U/克组织湿重)NS组49.210±4.3972 204.00±717.10 0.014 670±0.006 658LPS组158.100±19.220△4 232.00±425.70△ 0.203 700±0.063 790△5LD组118.900±19.000∗3 323.00±166.40∗ 0.120 700±0.006 658∗10LD组91.700±17.870#3 091.00±103.60# 0.082 670±0.024 030#20LD组62.780±5.636#2 786.00±78.42# 0.059 000±0.021 790#

注：与NS组比较，*P<0.05,△P<0.01;与LPS组比较，#P<0.01。

3 讨论

ALI在临床上多发生于严重创伤、大面积烧伤、大量失血、重度感染、脓毒症、胃内容物吸入、外科大手术后，并可进一步发展为ARDS，由于肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞的损伤，进而出现肺泡毛细血管屏障破坏、肺间质水肿、进行性低氧血症、呼吸窘迫等临床综合征[3]。其中，中性粒细胞聚集可对肺血管内皮细胞造成损伤，而炎症因子可直接作用于肺血管内皮细胞，或通过多种炎症通路导致肺损伤，继而引起炎症放大级联反应，最终导致多脏器功能障碍甚至衰竭。在临床中因其高发病率和死亡率，引起临床医生的高度重视，但至今未发现治疗急性肺损伤的特效药物，呼吸支持技术认为是目前临床中治疗ALI/ARDS最重要的治疗手段[4]，主要包括小潮气量通气、呼气末正压、高频振荡通气、体外肺结合膜技术等。但ALI/ARDS发病机制复杂，病情严重且进展快，尽管应用先进的技术进行支持性治疗，但ALI/ARDS的病死率居高不下。因此其治疗方案成为当前迫切希望解决的难题,其分子机制也成了当前研究热点，近年来，关于其通路的研究主要包括P38MAPK、TLR4、NF-κB、RAGE、NLRP3/IL-1β等。LPS为革兰阴性细菌细胞壁的主要成分，可诱导多种组织器官炎症，破坏免疫系统，LPS刺激后，关键的炎性细胞因子包括TNF-α、IL - 6和IL-1β等释放并参与急性肺损伤的进展。本研究根据文献选择5 mg/kg LPS进行腹腔注射建立脓毒症急性肺损伤大鼠模型[5]，而腹腔注射给药方法一般为建立肺外源性损伤模型，炎症细胞多集中在肺间质和血管，故选取肺组织标本从整体去评估急性肺损伤程度。

利多卡因作为一种临床上常用的酰胺类局麻药，具有镇痛、抗心律失常的作用，还具有镇咳、抗炎、抗癫痫、抗癌药增敏、免疫调节等作用，特别是利多卡因的抗炎作用已经得到更广泛的认可，可抑制多种炎症介质的释放。利多卡因在临床上静脉用药一般为1～2 mg/kg,根据《医用实验动物学》里大鼠与人类用药量的转换系数(W)为6.25，则动物用药量为6.25～12.5 mg/kg，又因动物对药量耐受高于人类且本实验给药方法采取腹腔注射，吸收速度较慢，故选择5、10、20 mg/kg三个剂量。研究发现，内毒素注射前1 h开始静脉注射利多卡因并维持2 h，可显著降低脓毒症模型动物的病死率[6]。由于LPS给药后2～3 h炎症因子释放已经达到较高水平，为对早期炎症起到抑制作用，在模型建立前10 min预先给药，并将给药时间集中在前3 h，尽量达到稳定有效的血药浓度，消除治疗空白。

P2X7R在炎症反应中扮演着危险信号“感受器”的角色：即监视炎症部位危险信号ATP的释放情况，细胞损伤、机械刺激、缺血或病原体入侵诱导细胞内ATP释放到细胞外时，P2X7R被活化[7]。P2X7受体不仅可以通过较小的阳离子，如钠离子、钾离子和钙离子，也可以通过较大的阳离子，使得细胞外ATP升高，参与多种炎症反应。还有研究发现，利多卡因可通过三磷酸腺苷盐敏感钾离子通道，减轻细胞因子诱导的内皮和血管平滑肌细胞的损伤[8]，或者通过抑制细胞内钙的增加及p38 MAPK的活化，减弱小胶质细胞外ATP引起的促炎细胞因子的产生(包括TNF-α、IL-1β、IL-6)[9]。在之前的研究基础上，我们发现P2X7R与利多卡因的抗炎机制都与ATP、离子通道有关，然而有关两者之间的研究较少。Okura等[10]在蟾蜍卵母细胞上发现利多卡因可以通过非竞争性的方式抑制ATP在P2X7受体中诱发的电流，并不会影响ATP与P2X7R细胞外的三个结合位点，以上研究给予了我们新思路。本研究发现，LPS组肺组织结构明显受损，肺泡毛细血管扩张，肺泡腔有红细胞渗出，肺泡间隔水肿、大量炎症细胞浸润、出血，LPS组中W/D值明显高于NS组，表明LPS组肺水肿程度大于NS组，LPS组MPO活力明显高于NS组，表明中性粒细胞聚集较多；LPS组P2X7R蛋白表达均高于NS组，表明LPS注射后可诱导大鼠ALI造成肺组织病理损伤、肺水肿、肺组织中性粒细胞浸润，从而使ATP释放到细胞外引起P2X7R表达增加。本研究发现，20LD组肺泡结构基本完整，肺泡间隔水肿、炎症细胞浸润、出血均明显减轻，10LD组、20LD组W/D均低于LPS组，10LD组P2X7R蛋白表达低于LPS组，20LD组P2X7R、蛋白表达低于LPS组，5LD组、10LD组、20LD组MPO水平均低于LPS组，表明利多卡因可以减轻肺组织病理损伤程度，减轻肺水肿程度，减少肺组织中性粒细胞浸润，降低肺组织P2X7R表达水平，其中10 mg/kg和20 mg/kg的利多卡因剂量对ALI大鼠肺组织的保护作用较好，其机制可能与离子通道有关，给予利多卡因后ATP诱发的电流释放降低，从而降低P2X7R的表达。

NLRP3炎症小体参与多种疾病的炎症过程，NLRP3分子激活之后，与凋亡相关微粒蛋白(ASC)、Caspase-1前体共同结合成三分子复合物NLRP3炎症小体，自我切割激活Caspase-1。NLRP3和Caspase-1前体的激活促进IL-1β前体的成熟并在炎症细胞中释放[11]。还有研究表明，P2X7R的激动引起钾离子内稳态的剧烈变化是IL-1β成熟的一个重要因素[2]。P2X7R在介导炎症过程时需要NLRP3炎症小体、IL-1β的参与[12]，给予P2X7R抑制剂A438079和BBG可以抑制NLRP3/ASC/Caspase-1的激活，降低炎症因子表达[13]，表明P2X7R是NLRP3炎症小体、Caspase-1的上游信号分子。利多卡因的抗炎及免疫调节作用已经有很多研究，发现其可以减轻炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α、IL-18、HMGB1的表达，降低肺泡动脉血氧差，降低肺组织中性粒细胞聚集减轻肺损伤[14, 15]。本研究发现，10LD组NLRP3蛋白表达低于LPS组，20LD组NLRP3、Caspase-1蛋白表达均低于LPS组，5LD组、10LD组、20LD组IL-1β、HMGB1水平均低于LPS组，以上结果表明利多卡因可以通过抑制上游信号分子P2X7受体从而降低下游NLRP3、Caspase-1、IL-1β和HMGB1的表达，且20 mg/kg利多卡因治疗量对降低NLRP3、Caspase-1、IL-1β和HMGB1表达的作用较强。

综上所述，利多卡因可以减轻ALI大鼠的肺水肿程度，减少中性粒细胞聚集，改善肺组织病理损伤变化，降低炎症因子IL-1β、HMGB1水平及MPO活力，其机制可能与抑制P2X7R/NLRP3/Caspase-1信号通路有关。但利多卡因参与该信号通路的具体机制及是否有其他信号通路参加有待进一步研究。利多卡因的这一作用给临床上研发治疗ALI的药物提供了新的靶点、新的思路。