miR-125b对人心肌细胞HCM的保护作用及机制

解小霞，孙晓静，苏文炀 ，杨柳，李力，王薇，李婷，田永强

1武汉市中医医院，武汉430014；2湖北省中医院

急性心肌梗死(AMI)是临床常见的冠状动脉疾病之一，可导致冠状动脉供血减少、机体组织缺氧等症状，严重者在数分钟内发生心脏停搏[1]。心肌细胞凋亡、心室重构、心肌纤维化等均是心肌梗死后心肌细胞病变代偿的重要病理生理过程[2]。微小RNA(miRNA)是一类非编码RNA序列，通过与靶基因特异性结合抑制靶基因表达。研究显示，人体内约有半数以上的基因受miRNA的直接或间接调控，miRNA的异常表达与多种疾病的发生、发展密切相关[3]。在AMI进展过程中存在miRNA的异常表达谱，特异性表达的miRNA可作为AMI早期诊断的分子标记物[4]。2017年8月～2018年12月，本研究通过观察AMI患者血浆miR-125b的表达量，以及miR-125b对人心肌细胞HCM凋亡与增殖活力的影响，以炎症、免疫系统平衡为切入点，探讨miR-125b对人心肌细胞的保护作用，为AMI的防治提供有效治疗策略。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选取2017年8月～2018年12月在我院心内科诊治的AMI患者68例为AMI组。纳入标准：年龄30～75岁；符合AMI的相关诊断；肌钙蛋白I(cTnI)水平>0.1 ng/mL或肌酸肌酶同工酶(CK-MB)水平升高1倍；心电图ST段抬高或压低以及新发生存活心肌的丢失或者节段性室壁运动异常的影像学证据；心电图上出现病理性Q波，胸痛持续时间大于20 min。排除标准：心律失常、心力衰竭等心脏疾病、恶性肿瘤及其他免疫系统疾病等，另收集体检健康对照者50例作为正常对照组，排除心血管疾病、恶性肿瘤以及其他免疫系统疾病。所有受试者均签署患者知情同意书并通过伦理审查。

1.2 细胞与试剂 人心肌细胞HCM细胞购于中科院上海细胞库。Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司，real-time PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，TRIzol试剂来自美国Thermo Fisher Scientific公司，RIPA裂解缓冲液购自上海碧云天生物科技有限公司，MTT试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司，青霉素、链霉素购自Gibco BRL公司，荧光素酶检测试剂购自Promega北京生物技术有限公司，荧光素酶报告载体由Promega公司合成，Annexin V/PI检测试剂盒购自上海碧云天公司。流式细胞仪购自美国BD公司。miR-125b模拟物序列为5′-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3′，miR-125b引物序列为:5′-CTGGTCCTAGTCAAATACCCCA-3′，3′-ACGCAAATTCGTGAACGTT-5′。miR-125b mimics购自上海吉玛生物制药有限公司。GAPDH、炎性小体(NLRP3)、白细胞介素1β(IL-1β)、趋化因子2(CCL2)、趋化因子C-X3-C-配体1(CX3CL1)、补体应答基因-32(RGC32)兔抗人的单克隆抗体购自Abcam公司。

1.3 血清miR-125b表达检测 空腹采集所有研究对象的静脉血3～5 mL，3 000 r/min离心10 min，取上清1 mL。采用TRIzol一步法提取总RNA并纯化，逆转录成cDNA，实时荧光定量PCR法检测miR-125b表达情况。引物序列：miR-125b-F为5′-CTGGTCCTAGTCAAATACCCCA-3′，miR-125b-R为5′-ACGCAAATTCGTGAACGTT-3′；U6-F为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6-R为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应参数：90～95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，PCR反应进行30个循环，72℃延伸10 min，反应体系为20 μL，以U6为内参，所得数据采用2-ΔΔCt法进行表达量相对定量分析。

1.4 细胞增殖活力检测 采用CCK-8法测定HCM细胞相对增殖率的影响。取对数生长期HCM细胞，加入DMEM培养基，调整细胞密度为1×105/mL，接种于96孔板中，吸弃细胞培养基，加入PBS轻洗细胞2次，分别采用瞬时转染法将miR-125b mimics(浓度分别为200、100、50 nmol/L)及NC mimics(浓度分别为200、100、50 nmol/L)转染入HCM细胞，转染8 h后去除转染液，加入1 mL的OPTI-MEM培养基继续培养24 h及48 h。在荧光显微镜下观察示，转染效率达90%以上，表明转染条件可靠。加入配好的含10%CCK-8试剂的培养基，同时设置空白对照。37 ℃孵育1 h，用微型超声振荡器混匀后，在酶标仪上以试验波长为570 nm，参比波长为450 nm测定光密度值。细胞相对增殖率(%)=[(B-A)/B×100%]，A为miR-125b mimics或NC mimics转染组OD值，B为空白组OD值。每个实验重复3次，每次测量3次。

1.5 细胞凋亡检测 采用流式细胞术。将密度为1×105个/mL的HCM细胞接种于12孔板，吸弃细胞培养基，加入PBS轻洗细胞3次，除空白组外，2 h后吸去培养基，按上述miRNA mimics瞬时转染步骤进行瞬时转染，使miR-125b mimics终浓度分别为50、100 nmol/L，转染NC mimics终浓度为100 nmol/L，另设空白组，转染后于37 ℃、5% CO2的培养箱中继续培养24 h。加入胰酶消化细胞，PBS洗3次，分别加入5 μL FITC-annexin V和2 μL PI，常温下避光孵育10 min，补齐总体积至500 μL，4 ℃冰浴避光放置。过滤后在流式细胞仪上测定细胞早期凋亡的百分比。

1.6 细胞免疫、炎症相关蛋白表达检测 采用Western blotting法检测细胞免疫、NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32表达。按上述miRNA mimics瞬时转染步骤进行瞬时转染，使miR-125b mimics终浓度为200 nmol/L，另设NC mimics组(终浓度为100 nmol/L)、空白组，取对数生长期各组细胞，胰酶消化后加入细胞裂解液(RIPA)50 μL裂解细胞提取总蛋白，采用Bradford方法进行蛋白定量。采用SDS-PAGE电泳分离总蛋白，每道孔上样50 μg总蛋白质，电泳2 h后，采用湿法转膜至PVDF膜，将膜用5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃孵育一抗(1∶1 000稀释)过夜，次晨采用TBST漂洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3 000稀释)，37 ℃孵育1 h，ECL显影，保存图像，以β-actin为对照，采用Quantity One侧光密度值。实验重复3次。

1.7 miR-125b靶基因进行预测 采用荧光素酶实验。利用Targetscan、miRanda数据库对miR-125b靶基因进行预测，结果发现NLRP3与miR-125b存在9个连续的碱基互补配对。为检测miR-125b是否能够识别NLRP3-3′UTR区域，构建包含NLRP3 3′UTR(wt)区域以及荧光素酶报告基因的质粒，将质粒与100 nmol/L miR-125b mimics或100 nmol/L NC mimics共同转染入HCM细胞，使用双荧光素酶报告基因测定试剂盒，转染48 h后进行萤光素酶测定，实验重复3次。

2 结果

2.1 AMI组与正常对照组患者血清miR-125b水平比较 AMI组、正常对照组血清miR-125b水平分别为0.26±0.05、1.02±0.08，AMI组血清miR-125b表达水平低于正常对照组(P<0.01)。

2.2 不同时间、转染不同浓度NC mimics、miR-125b mimics的细胞增殖情况比较 24、48 h时，转染各浓度miR-125b的HCM细胞相对增殖率均高于转染NC mimics后(P均<0.05)。见表1。

表1 转染不同浓度miR-125b mimics、NC mimics细胞的增殖情况比较

注：与NC mimics比较，△P<0.01，*P<0.05。

2.3 转染NC mimics、miR-125b mimics的细胞早期凋亡情况比较 空白组、转染NC mimics终浓度100 nmol/L、miR-125b mimics终浓度50 nmol/L、miR-125b mimics终浓度100 nmol/L细胞的凋亡百分比分别为12.98%±1.42%、11.56%±1.27%、2.06%±0.33%、3.10%±0.23%，转染50、100 nmol/L miR-125b mimics后HCM细胞的早期凋亡百分比均低于转染NC mimics后(P<0.05或0.01)。见图1。

2.4 转染miR-125b后NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32蛋白表达比较 转染miR-125b mimics 200 nmol/L后HCM细胞内NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32的表达量均较NC mimics组降低(P<0.05)，见表2、图2。

2.5 双荧光素酶报告分析结果 相比于NC mimics组，pMIRREPORTER -NLRP3WT-luc和 miR-125b mimics共转染明显降低NLRP3的3′UTR区荧光酶活性(P<0.01)，而pMIR-REPORTER-NLRP3 MUT-luc和miR-125b mimics及NC mimics组共转染均无此作用。结果表明，miR-125b mimics通过直接靶向作用于NLRP3的3′UTR区域，抑制HCM细胞中NLRP3的表达，见图3。

3 讨论

miRNA是一类长20～24个核苷酸的非编码小RNA分子，在动植物中广泛存在，通过特异性作用于靶基因，导致靶基因沉默或降解，参与机体内多种病理、生理过程[5]。2008年，科学家在人血浆和血清中检测到miRNA的存在，并且发现血循环miRNA可通过血液运送到相关靶器官，调节靶基因的表达而影响机体的生物学、病理学功能[6]。目前，血循环miRNA在冠状动脉粥样硬化及心肌细胞保护等方面的作用开始成为学者重点关注的方向[7]。

注：A为空白组，B为转染NC mimics 100 nmol/L，C为转染miR-125b mimics 100 nmol/L，D为转染miR-125b mimics 50 nmol/L。

图1 转染NC mimics、miR-125b mimics的细胞凋亡情况(流式细胞术)

注：与空白组比较，*P<0.05，△P<0.01。

图2 转染miR-125b后NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32蛋白表达情况(Western blotting法)

注：与NC mimics组相比，**P<0.01。

图3 双荧光素酶活性检测

2009年，研究人员首次在大鼠AMI模型中发现miR-206显著高表达，并与AMI进展存在一定的相关性[8]。研究发现，miRNA对AMI大鼠有正面调节作用，其中miR-98、miR-29、miR-1可有效增强心肌纤维化的收缩力[9]。急性非ST段抬高性心肌梗死(NSTEMI)患者血浆miR-1、miR-21、miR-423-5p、miR-133a表达量均上升3～5倍，提示miRNA表达谱与AMI疾病进展具有潜在的相关性[10]。同期，研究人员从相关文献中检索出119种AMI特异性miRNA，通过Targetscan靶点及GO功能分析，表明这些miRNA参与心血管疾病的发病过程，其中，miR-106b和miR-15b可分别作为AMI中血管凋亡和再生的调节因子[11]。生物信息分析人员通过二代测序技术分析了50例AMI患者的miRNA差异表达谱，结果发现miR-146a、miR-150、miR-155在AMI患者体内存在差异表达，其中miR-146a 50%在人心脏中表达，表明miRNA在不同组织中表达存在显著差异性[12]。

研究表明，miR-125b在心脏组织中表达较为丰富，与心肌细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程密切相关[13]。miR-125b表达水平与心肌缺血心脏恢复能力呈正相关关系，缺血后适应处理后miR-125b水平均不同程度增高，提示miR-125b可能参与心肌缺血恢复过程[14]。同时，miR-125b在AMI患者血清表达丰度均不同程度下降，并且在AMI动物模型中也得到了证实，提示miR-125b可能与AMI的发病进展密切相关[15]。本研究结果显示，相对于健康对照组，miR-125b在AMI组患者血清中表达水平显著降低，提示miR-125b可能与AMI后心肌细胞的功能保护与恢复相关；转染各浓度miR-125b的HCM细胞的相对增殖率均高于转染NC mimics后，表明转染miRNA-125b可促进HCM细胞的增殖，抑制HCM细胞凋亡，从而起到心肌细胞保护作用。

现代医学表明，动脉粥样硬化、脂类代谢紊乱、免疫功能失衡是导致AMI的主要因素，相关免疫细胞的分化与增殖可调控AMI疾病的进展[16]。作为模式识别受体家族的重要组成部分，NLRP3炎症小体在天然免疫系统中发挥着重要作用，与AMI的发生、发展密切相关。NLRP3炎症小体的活化可导致机体炎症反应激活与起始，炎症性的Ly-6Chigh单核细胞是AMI最早反应的免疫细胞，心肌缺血受损后特异性表达趋化因子CX3CL1、CCL2，进而促进单核细胞分泌VEGF和TGF-β，加速心肌HCM细胞修复[17]。VEGF、TGF-β、皮质激素、黄体生成素同时诱导免疫调节因子补体应答基因RGC32的表达，后者广泛参与肿瘤增殖、分化、炎症、转移等多种生物学过程。研究显示，RGC32在心脏缺血后心肌重塑过程表达显著上调，但目前关于RGC32对心肌梗死心肌细胞的影响及机制尚不清楚[18]。本研究发现，转染miR-125b mimics后HCM细胞内NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32的表达量较转染NC mimics后明显降低，表明miR-125b可抑制HCM细胞中免疫、炎症调节因子的激活，减轻心肌炎症性损伤。

综上所述，AMI患者血清miRNA-125b表达量显著降低，同时miRNA-125b可促进HCM细胞的增殖，同时可抑制HCM细胞凋亡，双荧光素酶实验验证了miR-125b 可直接靶向作用于NLRP3，并且miR-125b可显著抑制HCM细胞中免疫、炎症调节因子NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32蛋白的表达，从而抑制NLRP3/IL-1β通路激活，从而起到保护心肌细胞的作用。