牙周炎患者非刺激性全唾液、龈沟液及血清中CD147的表达及意义

柴 琳，张瑞敏,王亚敏，穆 森

牙周炎是一种以菌斑微生物为始动因子的感染性疾病，导致牙槽骨吸收、附着丧失和牙周袋形成等牙周组织破坏，最终造成牙齿脱落。牙周组织抵抗菌斑微生物同时产生免疫炎症反应，细菌及其代谢产物刺激牙周组织细胞产生炎症介质，包括基质金属蛋白酶 (MMPs)、细胞因子等[1]。MMPs等可进一步降解牙周组织中的胶原，造成附着丧失、牙周袋形成[2]。

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)是一种跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员。因其激活邻近的成纤维细胞产生MMPs而得名，研究证实EMMPRIN与牙周炎的延续和加重有关[3-4]。国际上EMMPRIN又称CD147[5]。诸多研究证明，通过调节CD147修饰与表达，可能进而调节MMPs在牙周炎中的作用，从而影响宿主的免疫炎症反应[4，6]。但CD147在牙周炎患者的非刺激性全唾液中是否表达，非刺激性全唾液、龈沟液、血清中CD147表达水平与牙周炎临床表现之间是否相关尚不明确，因而给予研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年1月至2018年5月就诊于哈尔滨医科大学附属第二临床医学院牙周黏膜科的20例牙周炎患者作为研究对象，其中，男10例，女10例，年龄(51.30±7.13)岁。上述患者由同一名口腔医师进行牙周基础治疗，6周后复诊。该组患者经确诊牙周炎并于治疗前,命名为治疗前；该组患者经治疗结束后6周复查者，为治疗后。选择同年就诊于哈尔滨医科大学附属第二临床医学院体检中心的20例牙周健康且无全身性疾病者作为健康对照组，其中男10例，女10例，年龄(46.85±6.08)岁。两组年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究中所有患者均知情并同意。

牙周炎患者纳入标准符合欧洲牙周病联合会(EFP)与美国牙周病学会(AAP)于2018年国际研讨会确定的牙周病新分类的诊断标准[7]，均为B级Ⅱ、Ⅲ阶段，且纳入患者还需符合以下条件：6个月内未做过牙周治疗；6个月内未使用抗生素、免疫制剂等；无吸烟习惯(包括从不吸烟和至少戒烟10年以上)；不伴有糖尿病、类风湿等全身系统性疾病；全口余留牙10颗以上。纳入健康对照组则需符合以下条件：无系统性疾病； 3个月内未使用抗生素及免疫调节药物等； 3个月内未进行牙周药物及手术治疗；非妊娠或哺乳期妇女；龈沟深度<2 mm，龈沟探诊不出血，无明显牙龈退缩。

1.2 研究方法

受检者均在相同条件下检测全口牙齿6个位点(颊、舌面的近中、中央、远中)的出血指数(bleeding index，BI)，牙周探诊深度(probing depth，PD)，附着丧失(attachment loss，AL)。上述各项临床指标的测量结果均取其平均值，并进行3组间评价。

唾液标本采集：按照Novakovic的方法[8]，于上午9：00—10：00，要求禁食2 h的参试者用无菌蒸馏水含漱3 min并全部吐出，保持不吞咽、不说话并静坐10 min，再吸取无刺激状态下分泌的唾液5 mL,14 000 r/min离心10 min，-80 ℃冻存待测。

龈沟液(GCF)采集：选取牙齿的4个邻面位点(包括1颗单根牙和1颗第一磨牙的近远中邻面位点，且该牙齿颈部无龋损和充填体)，刮除其龈上大块牙石及菌斑，隔湿并吹干牙面。用2 mm×8 mm Whatman滤纸条置入龈沟或牙周袋内，静置30 s后取出密封，-80 ℃冻存待测。

血清标本采集：抽取纳入对象的晨起空腹肘正中静脉血5 mL，4 ℃静置待血液充分凝固后，3 000 r/min离心10 min(离心半径为8 cm)，分离血清后分装,-80 ℃冻存待测。

采用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA)集中检测各组非刺激性全唾液、龈沟液和血清中CD147水平，操作严格按照试剂提供的实验手册进行，ELISA试剂盒为购自武汉市BOSTER生物科技有限公司。

1.3 统计学分析

应用SPSS 19.0软件对数据进行分析，计量资料采用均值±标准差；若各组数据符合正态分布且方差齐，则采用单因素方差分析；不符合正态分布或者方差不齐，则采用秩和检验：治疗前、治疗后的CD147水平及临床指标比较采用配对样本t检验和秩和检验(Wilcoxon test)；治疗前、治疗后与健康对照组间CD147水平及临床指标比较采用独立样本t检验和曼-惠特尼U检验。在控制了年龄及性别因素后，牙周治疗前后非刺激性全唾液、血清及龈沟液中CD147水平与PD、AL、BI的相关性采用偏相关分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 牙周临床指标比较

治疗前、后相比较,除AL外治疗后BI及PD显著低于，差异具有统计学意义(P<0.05)。与健康对照组相比，牙周炎患者治疗前BI及治疗前后PD、AL均相对较高, 两两间差异具有统计学意义(P<0.05)，但治疗后BI与健康对照组间并无差异(表1)。

2.2 非刺激性全唾液、龈沟液及血清中的CD147水平比较

非刺激性全唾液中，牙周炎患者治疗前CD147水平显著高于治疗后(t=-2.926,P=0.011)，且治疗前、后D147水平均高于健康对照组(t=4.279,P=0.001；t=3.226,P=0.004)，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 临床各组指标检测结果Tab.1 The results of clinical parameters

龈沟液中，牙周炎患者治疗前CD147水平显著高于治疗后(t=-6.608,P=0.000)，且治疗前、后D147水平高于健康对照组(t=-2.776,P=0.015；t=-2.226,P=0.013)，差异具有统计学意义(P<0.05)。

血液中，牙周炎患者治疗前CD147水平高于治疗后(t=-2.776,P=0.015)，差异具有统计学意义(P<0.05)。治疗前、后CD147水平与健康对照组相比差异不大(t=0.898,P=0.373；t=0.548,P=0.588)，无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2各组非刺激性全唾液、龈沟液和血液中CD147水平

CD147治疗前治疗后健康对照组非刺激性全唾液1.25±0.740.71±0.340.37±0.21龈沟液0.40±0.070.33±0.100.27±0.13血液1.13±0.340.95±0.331.02±0.34

2.3 各组间临床指标与非刺激性全唾液、龈沟液及血清中CD147水平比较

经牙周基础治疗6周后，牙周炎患者的BI、PD与非刺激性全唾液中CD147水平相关，具有统计学意义(P<0.05)；牙周炎患者的BI与龈沟液中CD147水平相关，具有统计学意义(P<0.05)(表3～5)。

表3 非刺激性全唾液中CD147水平与临床指标之间的相关性 Tab.3 Correlation of clinical parameters and CD147 levels in unstimulated whole saliva

表4 龈沟液中CD147水平与临床指标之间的相关性 Tab.4 Correlation of clinical parameters and CD147 levels in GCF

表5 血清中CD147水平与临床指标之间的相关性 Tab.5 Correlation of clinical parameters and CD147 levels in serum

3 讨 论

在口腔疾病中，CD147与牙周炎、根尖周炎、种植体周围炎和涎腺肿瘤等疾病的发生、发展具有密切联系,并且在口腔颌面部鳞癌中广泛表达，与肿瘤分化程度密切相关[4，9-15]。Dong等[16]通过免疫组化检测出炎性牙龈中CD147广泛表达于基底层细胞膜、上皮和上皮下结缔组织中,表达强度显著高于正常牙龈。有学者通过免疫过氧化物酶法定量分析，显示慢性牙周炎患者的牙周组织中CD147检出阳性率高,其次是慢性牙龈炎和健康者[3]。本研究通过ELISA发现牙周炎患者的非刺激性全唾液和龈沟液中CD147水平显著高于健康对照组，与Gülnihal研究结果[17]不一致。

牙周基础治疗是牙周炎的最基本治疗，可使牙周组织炎症消退[1]。本研究通过牙周治疗后，牙周炎患者的牙周指标除AL外均明显改善，且治疗后的BI及PD与健康组无明显差异。牙周基础治疗是消除菌斑微生物及减轻危险因素的有效手段，可降低宿主免疫炎症反应[1]。本研究中，牙周炎患者经牙周基础治疗后非刺激性全唾液、龈沟液和血液中CD147水平显著降低，且治疗后非刺激性全唾液和龈沟液中CD147水平高于健康对照组，提示CD147与牙周组织炎症密切相关。何艳萍等[18]通过对龈沟液中CD147进行检测得出同样结论，CD147在牙周健康人群和慢性牙周炎患者的龈沟液中均有表达，当牙周炎症临床症状较重时，龈沟液中CD147的表达也增多。本研究中经牙周基础治疗后，牙周炎患者的平均BI及PD改变量与非刺激性全唾液中CD147降低水平呈正相关，而龈沟液中CD147水平仅与BI呈正相关，提示龈沟液、非刺激性全唾液中CD147水平增加与牙周炎症严重性增加有关，认为CD147参与牙周炎的调节。

诸多学者认为，CD147参与牙周疾病进展过程的调节，可能与牙周组织的生理和病理过程有关[3-4]。Yang等[4]通过对实验性牙周炎小鼠抗CD147治疗，显微CT和组织学染色等检测发现抑制CD147能增加成骨标志物的表达水平，增加牙槽嵴高度，并能抑制牙周组织胶原纤维降解。Zhang等[6]通过GnT-V基因敲除发现可降低HIOECs中EMMPRin的糖基化水平，可降低MMP-2和MMP-9的活化并且抑制HIOEC/HGF共培养模型细胞外基质(ECM)的降解，从而影响牙周炎的宿主的免疫炎症反应。对CD147不同结构域及抑制CD147在牙周炎中发挥作用的机制需进一步研究，目前许多研究集中于牙龈上皮的检测。因临床诊疗中牙龈组织难以获取等问题，牙龈上皮的检测并不属常规。因而本研究着重于非刺激性全唾液、龈沟液及血清中的CD147进行比对。研究结果表明，牙周炎患者治疗前、后血清的中CD147水平与健康对照组间无明显差异，提示血液难以反映局限于牙周组织的炎症程度。相比龈沟液提取标准难以统一化而言，唾液中生物标志分子的分析具有易于采集、省时、量大、具有特异性信息等优势[19]。因此，非刺激性全唾液中CD147水平在牙周炎的诊疗判断方面具有良好前景。此外，了解CD147与牙周炎的相关性，有助于通过调节CD147帮助确定新的治疗干预[20]。

牙周组织炎症与CD147表达水平程正相关，但本研究纳入牙周炎对象均为B级Ⅱ、Ⅲ阶段，尚需扩大研究对象范围给予进一步研究评估，并进一步探索非刺激性全唾液中CD147表达水平能否为牙周炎的临床诊疗提供参考依据。