口腔扁平苔藓黏膜病损区微生物群落分析

王雪薇，唐 楠，赵知白，范 媛

口腔扁平苔藓(oral lichen planus, OLP)是一种由T细胞介导的慢性炎症性自身免疫性疾病，其患病率为0.5%～2.2%[1]，多见于中年女性。OLP依据临床表现包括斑纹型OLP和糜烂型OLP。尽管OLP的病因和发病机制尚未完全阐明，但OLP多与免疫系统失调有关[2]。

人类口腔中的微生物群落约有700多种，主要由放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroid-etes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobact-eria)和互养菌门(Synergistetes)组成[3]。口腔微生物与宿主免疫密切相关，宿主的活化状态和遗传易感性可由特定微生物触发或促进[4]。宿主和微生物群的平衡关系一旦被破坏可通过不同机制引起舍格伦综合征[5]、系统性红斑狼疮[6]和类风湿性关节炎[7]等自身免疫性疾病。

目前OLP患者口腔微生物群落的研究多通过收集唾液和黏膜拭子。黏膜拭子作为一种非侵入性、低风险且省时廉价的取样方法，多能被患者接受。He等[8]通过收集拭子发现OLP患者颊黏膜表面梭杆菌属(Fusobacterium)、纤毛菌属(Leptotrichia) 和劳特普罗菌属(Lautropia)相对丰度显著增加，而链球菌属(Streptococcus)相对丰度在正常对照组显著增加。为研究OLP患者口腔微生物群的变化，我们通过16S rDNA基因高通量测序，研究了斑纹型OLP、糜烂型OLP组和对照组口腔微生物群的组成概况，并评估了OLP组特定的微生物群落。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究招募2018年10—12月就诊于江苏省南京医科大学附属口腔医院口腔黏膜病科的受试者，共筛选24例OLP患者(12例斑纹型OLP和12例糜烂型OLP)和8名正常对照组，所有OLP患者均符合1978年WHO对口腔扁平苔藓的诊断标准[9]和2003年van der Meij等提出的临床和病理学诊断[10]。所有受试者的纳入标准如下：①年龄25～69 岁。②取样前1个月无抗生素及类固醇使用史、3个月未使用免疫调节剂。③无其他已知的口腔黏膜疾病、肿瘤和严重的系统性疾病史。排除标准：①药物或银汞材料引起的苔藓样反应。②妊娠期、哺乳期及服用避孕药者。③7 d内使用漱口水者。④被诊断为牙周炎、牙髓病或存在可见龋病。该实验经南京医科大学伦理学委员会批准，且提供纸质知情同意书，本研究程序符合赫尔辛基宣言。

1.2 样本采集

所有OLP样本均来源于患者颊或舌黏膜病损区的代表性部位，正常受试者样本来源于正常的颊或舌黏膜。嘱受试者漱口后，使用细胞刷(细胞收集器)紧贴在黏膜表面顺时针旋转20次收集黏膜表面微生物，立即储存在冻存管中，置于 -20 ℃下冷冻直至进一步分析。

1.3 DNA提取和PCR扩增

根据制造商的说明使用E.Z.N.A.®Soil DNA试剂盒 (Omega Bio-tek, Norcross, GA, 美国) 提取所有样本的微生物DNA，PCR扩增使用参数如下，95 ℃变性2 min，随后在95 ℃下变性30 s进行25个循环，55 ℃退火30 s， 72 ℃延长30 s，72 ℃温育5 min。靶向16S rDNA编码基因V3-V4高变区的通用PCR引物最终设计:341F:5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和806R:5′-GGACTACNNGGGTATCT-AAT-3′。

1.4 16S rDNA基因高通量测序

通过Illumina MiSeq平台(上海凌恩生物科技有限公司)按照标准程序进行配对测序(2×250)。

1.5 统计学方法

使用UPARSE(版本7.1)软件在 97% 的相似水平下进行 OTU 划分，并使用UCHIME嵌合序列识别和移除。采用RDP classifier对silva (SSU132)16S rDNA数据库中每个16S rDNA基因序列的系统发育关系进行分析，置信阈值为70%[11]。使用Usearch 软件(version 10)聚类和统计分析。采用Mann-WhitneyU检验计算各组间细菌类群的相对丰度。采用Mothur v.1.21.1[12]进行多样性分析，包括Chao1指数和Shannon指数。使用UniFrac[13]进行Beta多样性分析，比较主成分分析的结果，使用community ecology软件包和 R-forge (vegetarian 2.0)软件生成PCA图。线性判别分析效应大小(LEfSe)分析采用Kruskal-Wallis、Wilcoxon秩和检验和Spearman相关性检验细菌分类群间的变化和差异。所有统计分析均采用SPSS软件(版本23.0,美国)。P<0.05代表有统计学意义。

2 结 果

2.1 受试者和测序结果

所有受试者人口统计学和临床数据见表1，3组在年龄(P=0.143)和性别(P=0.152)方面无统计学差异。共获得了共1 443 822个高质量16S rDNA序列，优化数据的序列平均长度为423.66 bp。

表1 所有受试者人口统计学和临床数据Tab.1 The demographic and clinical data of all subjects

2.2 Alpha多样性

斑纹型OLP、糜烂型OLP组和对照组的微生物丰富度(Chao1 指数)和微生物多样性(shannon指数)，均未发现有统计学差异(P>0.05)。OLP患者颊/舌黏膜微生物丰富度(Chao1 指数)和多样性(shannon 指数)，也均未发现有统计学差异(P>0.05)(图1)。

2.3 样本间多样性的主成分分析

我们通过基于加权的UniFrac系统发育距离矩阵计算beta多样性来分析微生物群落结构间差异，在Bray-Curtis距离主成分分析(PCA)图(图2A)中我们发现3组样本间无明显分离(ANOSIM，P=0.771)。在图2B中，我们发现OLP组颊和舌黏膜样本间也无明显分离(ANOSIM，P=0.577)。

2.4 OLP组和对照组微生物群的组成差异

我们探讨了OLP组口腔微生物群落特征，并比较了3组之间微生物群落的丰度差异。在门水平上的总体微生物组成(图3A)表明，厚壁菌门是所有样本的主要优势门，其次是变形菌门和拟杆菌门。在属水平上(图3B)，链球菌属(Streptococcus)是主要的属，其次有奈瑟菌属(Neisseria)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)等。

A、B：斑纹型OLP、糜烂型OLP和对照组间Chao 1指数和Shannon指数；C、D：OLP组颊与舌黏膜Chao 1指数和 Shannon指数

图1不同分组Alpha多样性

Fig.1Alpha diversity of different groups

A：斑纹型OLP(绿色菱形)、糜烂型OLP(红色圆圈)和对照组(蓝色正方形)；B：OLP组颊黏膜(蓝色圆圈)和舌黏膜(红色正方形)；每个点代表一个样本，并按样本类型着色。相似的样本越多，其在图中就越接近

图2基于加权Unifrac距离矩阵的菌群主成份分析图

Fig.2Principal component analysis of flora basedon weighted unifrac distance matrix

与对照组相比，在属水平，艾肯菌属和小链菌属的相对丰度在OLP组显著较高。在种水平，脓肿分枝杆菌、马氏普雷沃氏菌、颊纤毛菌C-1013-b和苛养颗粒链球菌的相对丰度在OLP组显著较对照组高，其中，马氏普雷沃氏菌的相对丰度在糜烂型OLP组显著较斑纹型OLP组高(P=0.001)。土壤杆菌属的相对丰度在斑纹型OLP组(P=0.008)和糜烂型OLP组(P=0.032)均显著较对照组低，但斑纹型OLP和糜烂型OLP间无显著差异(P>0.05)。唾液链球菌唾液亚种在斑纹型OLP(P=0.003)和糜烂型OLP(P=0.000)的相对丰度均显著低于对照组，且在糜烂型OLP组最低。

绘制Venn 图(图3C)表示3组的共享和特有的OTU。结果表明，斑纹型OLP组、糜烂型OLP组和对照组的核心OTU分别由3 554个、3 398个和5 445个OTU组成，其中2 482个OTU为3组共有。

A、B：依次为对照组、斑纹型OLP组和糜烂型OLP组在门和属水平分类的柱状图；C：不同分组间微生物多样性的Venn图，不同组成部分中的数字表示3组间特有或共有的OTU序列数；绿色圆圈代表对照组，蓝色圆圈代表斑纹型OLP组，红色圆圈代表糜烂型OLP组

图3微生物群组成分析

Fig.3Analysis of microbial population composition

2.5 分类丰度差异

使用LEfSe图在不同物种水平进行分析，通过LDA得分来区分3组的口腔微生物群落(图4)。与对照组相比，气球菌科(Aerococcaceae)、贫养菌属(Abiotrophia)、小链菌属和柯林斯菌属(Collinsella)的相对丰度在斑纹型OLP组显著增加。而黄杆菌目(Flavobacteriales) 、埃格特菌科(Eggerthellaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、消化厌氧杆菌属(Peptoanaerobacter)和艾肯菌属的相对丰度在糜烂型OLP组显著较对照组高。小链菌属和柯林斯菌属相对丰度在OLP组显著较对照组高。

2.6 OLP组和对照组平均相对丰度>0.2% 的属相关性heatmap图分析

从图5我们可以看出，慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)和叶杆菌属(Phyllobacterium)最为正相关(ρ=0.92)，而慢生根瘤菌属和奈瑟菌属最为负相关(ρ=-0.56)。

2.7 未获培养或难获培养微生物

本研究结果发现细菌检出率为99.89%，有0.1%的微生物属于未获培养的微生物或未分类的群体。在能够分离培养出的细菌中，有0.007%的细菌在门水平未获培养或难获培养。

3 讨 论

微生物对疾病的作用不是因为它们的存在，而是由于微生物群落组成之间的失衡[14]。了解OLP患者与正常人之间微生物群的关系，可在预防和治疗OLP方面起重要作用。我们采用拭子收集的OLP病损区微生物群落，发现OLP组与对照组之间虽然微生物多样性、丰富度和群落结构方面无显著差异，但两组间微生物群落组成仍有不同。

A、B、C：依次为对照组和斑纹型OLP组、对照组和糜烂型OLP组、对照组和OLP组Lefse分析图(左)和LDA得分图(右)；仅列出LDA得分≥2

图4各分组分类丰度差异

Fig.4Difference in abundance of classificationof each group

圆圈越大，相关系数越高；蓝色代表正相关，红色代表负相关；相关值从-1.00(红色)到1.00(蓝色)

图5对照组和OLP组平均相对丰度>0.2%的属Pearson相关矩阵可视化图

Fig.5Pearson correlation matrix visualization of salivahealthy controls and OLP with genera averagerelative abundance>0.2%

在本研究中，我们发现OLP组马氏普雷沃氏菌的相对丰度显著较对照组高，且糜烂型OLP较斑纹型OLP高。该菌可从健康受试者的龈下菌斑中分离，也可从患有牙髓和牙周感染的患者中分离[15]。Said等[16]报道厌氧菌普氏菌属(Prevotella)与黏膜炎症反应有关。此外，Larsen[17]发现普氏菌属丰度的增加不仅与Th17介导的黏膜炎症相关，还能促进黏膜Th17免疫反应和中性粒细胞的募集，从而促进慢性炎症。本实验排除了患有牙髓病及牙周病的患者，因此我们认为马氏普雷沃氏菌丰度的增加可能与宿主免疫炎症反应有关。

与对照组相比，在OLP组相对丰度显著增加的微生物还有艾肯菌属、脓肿分枝杆菌和苛养颗粒链球菌。侵蚀艾肯菌(Eikenellacorrodens)可引起炎症和感染性疾病，包括种植体周围炎[18]和髋关节感染[19]。脓肿分枝杆菌在口腔多与菌斑相关[20]，有研究表明，OLP患者牙周状况较差[21]，因此，脓肿分枝杆菌可能参与了OLP的发展。苛养颗粒链球菌多与感染相关，如感染性心内膜炎[22]等疾病。

此外，OLP组和对照组间微生物组成的变化还可通过某些微生物相对丰度的减少来解释。我们发现斑纹和糜烂型OLP患者土壤杆菌属相对丰度均较对照组低。Kim等[14]发现属于变形菌门的土壤杆菌属相对丰度在特应性皮炎患者较健康皮肤低。Larsen等[23]研究表明2型糖尿病患者肠道变形菌门的比例明显较正常对照组低。唾液链球菌(Streptococcussalivarius)具有抗炎特性，Zheng等[24]报道患有湿疹婴儿的唾液链球菌相对丰度较对照低。本研究表明唾液链球菌唾液亚种的相对丰度在斑纹和糜烂型OLP组均低于对照组。

自然界中绝大多数微生物是未获或难获培养的[25]。虽然16S rDNA测序能够培养出绝大多数细菌，但仍有少量未获或难获培养的微生物。这些微生物中可能仍存在与OLP相关的致病菌。目前，我们仅初步探讨了OLP局部病损区细菌菌群。对于这些未获或难获培养的可疑微生物群可采用宏基因组学[26]、元转录组学[26]、反向基因组学[27]或设计针对性的PCR引物以进行检测。

综上所述，口腔微生物群在人类健康中发挥着重要的作用，口腔菌群失调不仅会导致口腔疾病，还会导致系统性疾病，且不同疾病状态及不同区域微生物定植情况有所差异[28]。OLP的发生和发展可能与微生物失调参与宿主免疫、炎症和感染有关。虽然我们的样本规模不大，但值得注意的是，我们发现OLP患者颊和舌黏膜病损区微生物多样性、丰富度和群落结构均无显著差异。为充分了解OLP患者各病损区微生物群的微妙变化，仍需行大规模研究，以探索OLP特定病损区微生物群落的改变，从而有助于为OLP制定更有效的预防和治疗策略。