海参磷脂对慢性应激诱导小鼠抑郁样行为的影响

张福诚，李 鹏，张 才，杨隆恩，黄城益，张永平，宋 采,2

海参磷脂对慢性应激诱导小鼠抑郁样行为的影响

张福诚1，李 鹏1，张 才1，杨隆恩1，黄城益1，张永平1，宋 采1,2

（1. 广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088；2. 广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518120）

【】探究海参磷脂对慢性不可预知性应激（CUMS）诱导小鼠产生抑郁样行为的影响及机制。将昆明小鼠（KM）随机分为对照组、模型组和海参磷脂低、高剂量组，对照组外的三组小鼠进行连续60 d的CUMS，同时，低、高剂量组每天分别灌胃50 mg/kg和100 mg/kg海参磷脂，模型组和对照组灌胃等体积生理盐水。应激结束后进行旷野和高架十字迷宫行为学实验，酶联免疫法检测血清糖皮质激素（GC）的含量，高效液相色谱（HPLC）检测海马区的五羟色胺（5-HT）水平。与对照组相比，模型组小鼠旷野实验5 min内水平活动、垂直运动均明显减少（<0.01），高架实验5 min内小鼠进入高架开放臂次数显著减少（<0.05），开放臂时间显著减少（<0.01），血清GC显著升高（<0.01），海马区5-HT含量显著降低（<0.05），五羟吲哚乙酸（5-HIAA）显著升高（<0.05），5-HT/5-HIAA比值显著降低（<0.05）。海参磷脂可改善CUMS诱导致小鼠抑郁样行为，与其抑制GC分泌和5-HT降解活性有关。

海参磷脂；抑郁；行为学检测；五羟色胺（5-HT）；糖皮质激素（GC）

抑郁症是一种高患病率、高复发率、高致残率及高自杀率的严重精神疾患，其发病原因包括单胺类缺乏假说[1]、神经营养因子缺乏假说[2]、下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴功能障碍假说[3]和免疫炎症假说[4]等。其中单胺类缺乏假说认为抑郁症的发生伴随着单胺类神经递质如五羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA)等浓度下降，而这类神经递质在中枢神经系统中具有调控精神活动、情绪反应、体温调节和学习记忆等功能[5]。当前针对抑郁症的临床治疗药物存在副作用大、患者服药依从性差、复发率高等问题。针对单胺类缺乏而治疗抑郁症的主流药物包括选择性五羟色胺再摄取抑制剂（SSRI，代表药物帕罗西汀、舍曲林、氟西汀等），此类药物存在明显的副作用，包括失眠、头痛（头晕）、烦躁等不良反应[6-7]。因此，开发天然的无毒副作用的药物具有重要意义。

海参是一种传统滋补食品和海洋药材，海参体壁富含海参多糖、海参皂苷、海参脑苷脂、神经节苷脂、海参胶原蛋白。海参磷脂作为海参体壁的主要成分，富含EPA等不饱和脂肪酸[8]。研究发现，海参具有抗肿瘤、增加免疫等作用[9]，且海参磷脂有抗氧化应激、保护神经和改善记忆等功效[10-12]。而海参磷脂在抑郁症中的作用尚未见报道。

在抑郁症的动物模型中，包括脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）腹腔注射模型[13]、嗅球摘除手术[14]和慢性不可预知应激（CUMS）[15]等。LPS模型持续时间短，嗅球摘除手术小鼠死亡率高，而CUMS模型维持时间长，模型稳定，其发病机理与人类更为相似[16]。因此，笔者用CUMS诱导小鼠建立抑郁模型并以海参磷脂灌胃，通过行为学分析，探究海参磷脂对小鼠抑郁样行为的影响及对应激激素和神经递质调控的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 性成熟的6~8周龄昆明小鼠（KM），购自长沙市天勤生物技术有限公司（合格证：No.37009200018913）。饲养环境：每笼（290 mm×178 mm×160 mm）饲养小鼠3只，温度(23 ± 1)℃，湿度(50 ± 10)%，12 h光照-黑暗循环的标准实验动物房，充足水源和饲料。所有实验动物的饲养和操作均遵守广东海洋大学实验动物饲养和使用的相关规定。

1.1.2 主要仪器和及材料 海参磷脂从南方糙海参（深圳太丰生物科技有限公司提供）干粉经冷丙酮和乙醇逐步萃取所得的磷脂乙醇不溶物部分，色泽为白色至淡黄色粉末，其脂肪酸组成检测由武汉迈特维尔生物科技有限公司负责，主要成分见表1。HPLC甲醇购自广州化工试剂厂，柠檬酸购自天津市北辰方正试剂厂，无水乙酸钠购自广东光华科技股份有限公司，高架十字迷宫、旷野箱购自上海欣软信息科技有限公司，高效液相色谱购自安捷伦仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 将40只KM小鼠随机分为4组，每组10只，各组小鼠体质量无显著性差异（>0.05），具体分组给药情况如表2。根据实验动物与人等效剂量换算法[17]换算海参磷脂给药剂量为50 mg/kg (每只小鼠给与2.5 mg)、100 mg/kg (每只小鼠给与5.0 mg)，以生理盐水溶解灌胃。

1.2.2 慢性应激模型的建立 实验开始前动物适应新环境7 d，各组小鼠每天按表1给予相对应处理，对照组和模型组给予生理盐水灌胃，模型组和海参磷脂组每天随机给予两种应激源刺激（表3），7周后进行行为学检测。

表1 磷脂主要成分

表2 实验分组

表3 应激项目及日期

说明：D（= 1, 2, …,41）表示第天。

1.2.3 行为学实验

1.2.3.1 旷野行为实验 应激50 d，给予海参磷脂60 min之后开始行为学测试。将KM小鼠放入长宽高均为40 cm的黑箱中，给予强光刺激，让其自由探索5 min，记录其在旷野箱中的运动总路程（cm）。

1.2.3.2 高架十字迷宫行为实验 每只小鼠先完成旷野测试后立即进行高架十字迷宫测试。将KM小鼠放入高架开放臂和封闭臂中间部分，头朝向开放臂，给予强光刺激，让其自由探索5 min，分别记录其进入开放臂、封闭臂的次数和时间s）。

1.2.4 血清糖皮质激素的检测 小鼠断头取血于1.5 mL离心管中，离心10 min（1 000 r/min），吸出上清于-20℃保存备用，检测时提前30 min取出，待恢复至室温，以ELISA试剂盒检测糖皮质激素。检测试剂盒购自北京冬歌生物科技有限公司，步骤参见该说明书。

1.2.5 海马脑区神经递质的检测

1.2.5.1 样品处理完成行为学测试后牺牲小鼠，冰上快速剥离出脑海马组织于液氮中速冻，-80℃保存备用。取脑组织称重（约20 mg），在组织裂解液中匀浆，冷冻离心机（12 000 r/min，4 ℃）离心15 min，取上清，加入等体积高氯酸沉淀剂，冰浴10 min，再次离心（12 000 r/min，4℃）时间为15 min，用规格为0.45 um孔径的滤膜过滤到样品瓶中，供分析。

1.2.5.2 标准储备液配制 精确称取5-HT、5-HIAA标准品，加入标准溶剂定容至0.10 mg/mL标准储备液，-80 ℃保存，使用时以标准品稀释液逐步稀释到所需浓度。

1.2.5.3 色谱条件和检测参数 使用Agilent Poro-Shell 120 EC-C18 柱（150 mm×4.6 nm，4 μm，美国安捷伦科技有限公司），流动相为柠檬酸-乙酸钠缓冲液（50 mmol/L柠檬酸、50 mmol/L乙酸钠、0.5 mmol/L 1-庚烷磺酸钠、5 mmol/L三乙胺、0.5 mmol/L Na2EDTA）-甲醇（体积比87∶13，pH 3.8）；流速1.0 mL/min，进样量为20 μL，发射波长330 nm，激发波长280 nm。

1.2.5.4 数据分析 对比标准品的峰面积与神经递质质量分数的比值，以公式样/样=标/标计算出每个样品中的神经递质质量分数（ng/mg）。

1.3 统计学处理

用SPSS 19.0进行数据处理，单因素方差分析（one-way ANOVA），结果用平均值±标准误表示（Average±SEM），LSD事后分析比较各组的区别，<0.05表示差异有统计学意义。统计图用Graphpad Prism绘制。

2 结果与分析

2.1 海参磷脂对CUMS诱导的小鼠焦虑抑郁行为的改善作用

2.1.1 旷野实验结果 旷野实验结果如图1所示，与对照组（61 208.31 ± 3 232.03）cm相比，模型组小鼠水平活动距离为（40 193.47 ± 2 334.68）cm，显著减少（<0.000 1），同比降低52.28%；与模型组相比，海参磷脂高剂量组小鼠水平活动距离为（58 710.04 ± 4 254.57）cm，显著增加（<0.01），同比增加了46.07%。与对照组（41.33 ± 2.62）次相比，模型组小鼠垂直活动次数为（26.67 ± 3.68）次，显著降低（<0.01），同比降低55%；与模型组相比，海参磷脂高剂量组小鼠垂直活动次数为（41.44 ± 5.13）次，显著增加（<0.01），同比增加了55.42%。实验表明，海参磷脂100 mg/kg可以改善CUMS诱导的小鼠在旷野实验中的焦虑行为。

1. 对照组；2. 应激组；3. 应激+50 mg/kg海参磷脂；4. 应激+100 mg/kg海参磷脂；##，P < 0.01；####，P < 0.000 1 vs.对照组；**，P < 0.01 vs.慢性应激组

2.1.2 高架十字迷宫实验结果 高架十字迷宫实验结果如图2所示，与对照组（63.88 ± 6.98）s相比，模型组小鼠开放臂进入时间为（43.08 ± 5.31）s，显著减少（<0.01），同比减少48.26%；与模型组相比，海参磷脂高剂量组小鼠开放臂进入时间为（74.27 ± 9.91）s，显著增加（<0.01），同比增加了72.39%。与对照组（9.38 ± 1.69）次相比，模型组小鼠开放臂进入次数为（5.83 ± 0.78）次，显著减少（<0.05），同比减少60.71%；与模型组相比，海参磷脂高剂量组小鼠开放臂进入次数为（9.64 ± 0.73）次，显著增加（<0.001），同比增加65.19%。实验表明，海参磷脂100 mg/kg可以改善CUMS诱导的小鼠在高架迷宫实验中的焦虑行为。

1. 对照组；2. 应激组；3. 应激+50 mg/kg海参磷脂；4. 应激+100 mg/kg海参磷脂；#，P<0.05；##，P<0.001 vs.对照组；**，P<0.01 vs.慢性应激组

2.2 海参磷脂对CUMS诱导的小鼠神经递质变化的改善作用

图3为神经递质的检测结果，与对照组（39.39±2.24）ng/mg相比，模型组五羟色胺（5-HT）质量分数为（32.97±1.63）ng/mg，显著降低（<0.05），同比降低19.45%；与模型组相比，海参磷脂高剂量组5-HT质量分数为（37.05±0.84）ng/mg，显著上升（<0.05），同比增加12.36%。与对照组（19.17±1.10）ng/mg相比，模型组五羟吲哚乙酸（5-HIAA）质量分数为（24.49±1.84）ng/mg，显著升高（<0.05），同比升高21.72%；与模型组相比，海参磷脂高剂量组5-HIAA质量分数为（16.83±0.91）ng/mg，显著降低（<0.05），同比降低31.26%。与对照组（2.02±0.15）相比，模型组5-HT/5-HIAA比值为（1.56±0.16），显著降低（<0.05），同比降低29.04%；与模型组相比，海参磷脂高剂量组5-HT/5-HIAA比值为（2.11±0.16），显著上升（<0.05），同比增加34.81%。实验表明，海参磷脂100 mg/kg可以改善CUMS诱导的小鼠的海马脑区的五羟色胺神经递质的释放和降解。

2.3 海参磷脂对CUMS诱导的小鼠血清糖皮质激素（GC）变化的改善作用

图4为糖皮质激素的检测结果，与对照组（3.12±0.04）ng/mL相比，模型组糖皮质激素为（3.54±0.06）ng/mL，显著升高（< 0.000 1），同比升高12.09%；与模型组相比，海参磷脂低剂量组、高剂量组的糖皮质激素分别为（3.35±0.11）ng/mL、（3.35±0.06）ng/mL，均显著降低（<0.05），分别降低5.44%和5.53%。实验表明，海参磷脂50 mg/kg、100 mg/kg均可以改善CUMS诱导的小鼠血清中糖皮质激素的过度释放。

1. 对照组；2. 应激组；3. 应激+50 mg/kg海参磷脂；4. 应激+100 mg/kg海参磷脂；#，P<0.05 vs.对照组；*，P<0.05；**，P<0.01 vs.慢性应激组

1. 对照组；2. 应激组；3. 应激+50 mg/kg海参磷脂；4. 应激+100 mg/kg海参磷脂；####，P < 0.000 1 vs.对照组；*，P<0.05 vs.慢性应激组

3 讨论

通过慢性应激诱导的小鼠抑郁模型研究海参磷脂对抑郁症的影响，结果发现饲喂海参磷脂可有效改善小鼠的抑郁行为，其作用可能与其调节应激激素的释放和神经递质的变化有关。

在行为学实验中，CUMS诱导小鼠在旷野实验中水平活动和垂直活动减少，在高架实验中进入开放臂探索次数、时间均减少，这些行为均反映出小鼠的焦虑行为，其活动能力降低、兴趣减退、探索行为减少，这些结果与许晶等[18-21]结果一致，说明慢性应激成功诱发小鼠的抑郁症状。而在应激同时灌胃海参磷脂后，小鼠以上的行为学改变可不同程度得到改善，尤其是其中海参磷脂高剂量组小鼠在旷野实验中水平活动量、垂直活动均增加，高架开放臂探索次数、时间均有显著增加，效果均好于低剂量海参磷脂组，说明海参磷脂具有较明显的抗抑郁作用，其作用与剂量呈现一定依赖关系。

抑郁症常与长期的紧张环境刺激有密切关系，长期紧张造成机体的应激，激活HPA轴引起体内应激激素升高，在抑郁的发病机制中有重要意义[22]。本实验中，CUMS诱导小鼠血清糖皮质激素水平升高，说明在长期应激作用下，小鼠HPA轴持续激活，导致肾上腺持续分泌糖皮质激素，引起神经内分泌系统紊乱，这可能是造成小鼠表现抑郁行为的原因之一。而本实验小鼠应激同时灌胃海参磷脂，不管海参磷脂高、低剂量均显著降低了小鼠血清中GC含量，说明海参磷脂有助于改善应激引起的HPA轴功能的紊乱，这可能是海参磷脂表现出抗抑郁作用的重要原因。

根据神经递质缺失假说，调控情绪相关的神经递质的减少是诱发抑郁症的重要因素。在本实验中，CUMS诱导小鼠海马脑区的5-HT含量降低，而5-HT代谢物5-HIAA升高，且5-HT/5-HIAA比值降低，说明在CUMS诱导的抑郁症中，5-HT代谢程度增加，从而使脑中5-HT水平降低，这与姚迪等人的结果一致[23]，均符合抑郁5-HT能降低假说。而海参磷脂高剂量组小鼠脑中的5-HT含量及其与代谢产物5-HIAA比值的异常均得到显著改善，这可能与海参磷脂改善HPA功能，减少GC的释放有关。GC可通过犬-尿氨酸代谢途径调控神经递质的生成和代谢[24-25]，这可能是海参磷脂改善抑郁作用的机制之一。

鉴于海参磷脂的抗抑郁作用，分析磷脂组成，结果表明，海参磷脂乙醇不溶物部分富含磷脂酰肌醇和溶血磷脂酰肌醇。磷脂酰肌醇信号传导通路在细胞增殖和凋亡中伴有重要的作用[26-28]，因此海参磷脂也可能通过调节神经细胞凋亡而起到神经保护作用，这有待进一步研究。

4 结论

海参磷脂100 mg/kg可以有效的改善CUMS诱导的小鼠抑郁样行为；海参磷脂调节HPA轴、抑制GC释放，改善神经递质5-HT代谢是可能机制，尚需要进一步验证。

[1] DELGADO P L. Depression: the case for a monoamine deficiency.[J]. Journal of Clinical Psychiatry, 2000, 61 (Suppl 6): 7-11

[2] 王娜, 黄芹, 鲍天昊, 等.神经营养因子假说与抑郁症发病机制的研究进展[J]. 四川精神卫生, 2019, 32(1): 81-85.

[3] 左玲俊, 徐俊冕. HPA轴功能与抑郁症[J]. 中国心理卫生杂志, 2001, 15(2): 112-113.

[4] 汪崇泽, 盛国红. 免疫炎症途径与抑郁症的研究进展[J]. 精神医学杂志, 2015, 28(5): 397-400.

[5] 李艺, 杨欢. 单胺类神经递质及其受体在抑郁症免疫失衡中的作用[J]. 国际免疫学杂志, 2008, 31(3): 204-208.

[6] 冯殿伟. 抑郁症治疗靶标及其药物研发进展[J]. 中国医院药学杂志, 2018, 38(4): 443-449.

[7] 欧红霞, 陈平, 傅强. 使用5-羟色胺再摄取抑制剂150例病人的不良反应分析[J]. 中国新药与临床杂志, 2002, 21(12): 711-713.

[8] CAREAGA V P, MUNIAIN C, MAIER M S . Fatty acid composition of the edible sea cucumber[J]. Natural product research, 2012, 27(7): 1-9

[9] 林明宝, 白金叶, 丁亚思, 等. 海参提取物对免疫功能低下模型小鼠免疫功能的调节作用[J]. 中国药房, 2015(4): 451-454.

[10] SONG C, LEONARD B E. The effect of olfactory bulbectomy in the rat, alone or in combination with antidepressants and endogenous factors, on immune function[J]. Human Psychopharmacology: Clinical and Experimental, 1995, 10(1): 7-18.

[11] 许晶, 李晓秋. 慢性应激抑郁模型的建立及其评价[J]. 中国行为医学科学, 2003(1): 14-17.

[12] 何茹, 肖云, 冯小红. 慢性应激对大鼠前额叶脑源性神经营养因子表达的影响[J]. 中国行为医学科学, 2008, 17(6): 523-524.

[13] WU F J, XUE Y, LIU X F, et al. The protective effect of eicosapentaenoic acid-enriched phospholipids from sea cucumberon oxidative stress in PC12 cells and SAMP8 mice[J]. Neurochemistry International, 2014, 64: 9-17.

[14] 王颖, 李忠辉. 海参磷脂对阿尔兹海默病模型大鼠认知功能的影响[J]. 中国临床研究, 2019, 32(7): 915-918.

[15] 丁宁. 两种海参极性脂质对Aβ致老年性痴呆的保护作用研究[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2015.

[16] 渠翔, 胡德荣, 赵雪, 等. 替米沙坦对脂多糖诱导的抑郁模型大鼠行为、脑内炎症反应及BDNF信号通路的影响[J]. 中南药学, 2017(2): 40-43.

[17] 黄继汉, 黄晓晖, 陈志扬, 等. 药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2004, 9(9): 1069-1072.

[18] 吕红, 钱家鸣, 金光亮, 等. 慢性应激抑郁模型的感觉和动力评价[J]. 临床消化病杂志, 2015(6): 323-326.

[19] 焦爽. 电针干预慢性应激抑郁模型大鼠行为学与认知功能及其机制[C]. 中国中西医结合学会. 第三届世界中西医结合大会论文摘要集,2007: 154.

[20] 陈华德. 电针百会穴对慢性应激抑郁模型大鼠行为学的影响[C]. 中国针灸学会. 中国针灸学会2009学术年会论文集（上集）,2009: 391-395.

[21] 安改红, 陈学伟, 王静, 等. 姜黄素预处理对慢性心理应激大鼠中枢神经的保护作用[J]. 解放军预防医学杂志, 2013, 31(1): 16-19.

[22] 陈姣, 楚世峰, 陈乃宏, 等. 糖皮质激素与抑郁发病相关机制研究进展[J]. 中国药理学通报, 2013, 29(11):1493-1495.

[23] 姚迪, 胡欣妍, 苏兴国, 等. 舒肝解郁饮对抑郁大鼠脑组织单胺类神经递质及其代谢产物的影响[J]. 吉林大学学报：医学版, 2007(4):704-707.

[24] 杨桃, 张静, 李丽娜, 等. 培元解郁方对急性糖皮质激素诱导SD大鼠的抗抑郁作用及TRY-KYN代谢途径的调节[J]. 世界中医药, 2018(8):1964-1967,1971.

[25] 查翠芳. 色氨酸代谢物犬尿氨酸途径的调节和功能[J]. 广东饲料, 2019, 28(03):53.

[26] 刘剑, 李立, 王晓川, 等. 亚低温通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路对肝缺血再灌注损伤大鼠模型的保护作用[J]. 临床肝胆病杂志, 2019(4): 846-851.

[27] 王耀伍, 张宏义, 尹春丽, 等. 人尿激肽原酶通过激活PI3K/Akt信号通路减轻大鼠脑缺血再灌注损伤[J]. 中华神经医学杂志, 2019, 18(5): 459-463.

[28] 吴丹. PI3K/Akt信号通路在抑郁症及抗抑郁中药作用机制研究中的进展[J]. 中草药, 2019, 50(18): 4461-4469.

Effect of Sea Cucumber Phospholipid on Depression-like Behavior Induced by Chronic unpredictability Stress in Mice

ZHANG Fu-cheng1, LI Peng1, ZHANG Cai1, YANG Long-en1, HUANG Cheng-yi1, ZHANG Yong-ping1, SONG Cai1,2

(1.,,524088,; 2.,518120,)

To investigate the effect and mechanism of sea cucumber phospholipid on depression-like behavior induced by chronic unpredictable stress (CUMS) in mice.KM mice were randomly divided into four groups: control group, CUMS group, sea cucumber phospholipid low dose group (L) and high dose group (H). The three tested groups were given different levels of continuous CUMS for 60 days. The L group and H group were given 50 and 100 mg/kg respectively of sea cucumber phospholipid daily. Then, the Open Field Test (OFT) and Elevated Plus Maze test (EPM) were used to assess depression-like behaviors. The concentration of serum glucocorticoid (GC) were detected by ELISA. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to detect hippocampus serotonin levels.Compared with control, there is a significant decreased in the number of rearing and locomotors in OFT, the number and the time of entries into the open arms in EPM were found in CUMS group. Additionally, the concentration of serum GC and hippocampus 5-HIAA were significantly increased, while the 5-HT content in hippocampus and the ratio of 5-HT/5-HIAA were significantly decreased in the CUMS group. However, the changes induced by CUMS can be significantly improved by sea cucumber phospholipid.Sea cucumber phospholipid can improve CUMS-induced depression-like behavior in mice. This may be related to the inhibition of GC secretion and 5-HT degradation.

Sea cucumber phospholipids; depression; behavioral test; serotonin; glucocorticoid

R749.4

A

1673-9159（2020）02-0083-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.02.012

2019-11-14

广东省促进经济发展专项资金（海洋经济发展用途）项目（粤自然资源合[2019]015号）；广东省科技计划项目(2016B020235001)；深圳大鹏新区产业发展专项资金扶持项目 (KY20170210和Y20180201)；湛江市科技项目（2018A01045）；广东海洋大学创新强校项目(GDOU2013050102)；广东海洋大学科研启动项目(R19038)

张福诚（1993－），男，硕士研究生，研究方向为神经免疫药理学与海洋药物研发。E-mail: 2472349965@qq.com

宋采（1956－），女，博士，教授，研究方向为精神神经免疫学和海洋活性物质药理学。E-mail: cai.song@dal.ca

张永平（1979－），男，副教授，研究方向为神经退行性疾病的研究及海洋保健食品的研发。E-mail: zhangyp2015@163.com

张福诚，李鹏，张才，等. 海参磷脂对慢性应激诱导小鼠抑郁样行为的影响[J]. 广东海洋大学学报，2020，40（2）：83-88.