罗非鱼干扰素诱导蛋白35基因克隆及表达分析

黄 瑜，马嘉霖，周棉鑫，陈敏琪，蔡 佳，简纪常，汤菊芬

罗非鱼干扰素诱导蛋白35基因克隆及表达分析

黄 瑜1,2,3，马嘉霖1，周棉鑫1，陈敏琪1，蔡 佳1,2,3，简纪常1,2,3，汤菊芬1,2,3

（1. 广东海洋大学水产学院 // 2. 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室 // 3. 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，广东 湛江 524088）

【】研究尼罗罗非鱼（）干扰素诱导蛋白35（interferon induced protein 35，ifi35）在免疫反应中的作用。克隆获得罗非鱼基因开放阅读框序列（GenBank登录号：XM_003442606；），采用实时荧光定量PCR技术检测在健康罗非鱼不同组织中的分布，以及不同刺激物刺激后的表达。基因编码区为1 125 bp，编码374个氨基酸，理论分子质量为42.79 ku，等电点为5.01。含有1个LZD结构域和2个Nmi/IFP 35 domain (NID)。多序列比对发现On-ifi35与其它物种的ifi35氨基酸序列同源性介于35.23% ~ 93.32%之间，且与斑马拟丽鱼同源性最高。系统进化分析发现，与斑马拟丽鱼的ifi35聚为一支。实时荧光定量PCR分析显示，在健康罗非鱼各组织中均有表达，其中在脾脏组织中表达量最高，其次是胸腺、肝脏、心脏、肌肉、肠道、体肾、脑、鳃、头肾，在皮肤中表达量最低。经无乳链球菌和PolyI:C刺激后，表达量在脾脏、肠道、体肾和头肾中均发生显著性变化且呈现出显著的时序性。

尼罗罗非鱼；；基因；克隆；表达

干扰素（Interferon, IFN）是一类重要的α螺旋细胞因子，在脊椎动物先天性免疫防御系统中发挥重要的功能[1-2]。根据IFN的基因序列与基因结构，结合的受体和功能等方面，干扰素被分为I型（IFN-α和IFN-β）、I1型（IFN-γ）和III型（IFN-λs）。四足动物中拥有3种类型的干扰素，而硬骨鱼类仅具有I型和I1型IFN，缺少III型 IFN[3-5]。

干扰素主要通过改变特定基因的表达来影响细胞功能[6]。由干扰素诱导的干扰素诱导基因种类较多，如鸟苷酸结合蛋白、Mx、oligo（2-5A）合成酶、主要组织相容性复合物I类、II类和I11类基因、与血小板因子4相关的多肽家族、角蛋白K17、参与抗原呈递的蛋白质、吲哚胺2,3-双加氧酶和IFP 53/trypto-phanyl-tRNA合成酶等[7-8]。干扰素诱导蛋白35（interferon induced protein 35，ifi35）属于干扰素诱导蛋白的一种，哺乳动物人ifi35作为1.4 kb的单一mRNA种类存在，其中亮氨酸拉链结构域（leucine zipper domains，LZD）可促使基本区亮氨酸拉链（Basic region leucine zipper，bZIP）转录因子二聚化，形成1个邻近富含碱性氨基酸的双边DNA结合区[9]。ifi35另外2个相同的NMI/IFP 35结构域（NID）串联重复，介导NMI-NMI蛋白质相互作用和亚细胞定位[10]。目前ifi35的功能研究主要集中在哺乳动物当中，低等脊椎动物、鱼类ifi35的研究还非常欠缺。

尼罗罗非鱼（）作为联合国粮农组织推荐的世界性养殖品种，近年来养殖产业受到各种病原菌威胁，如细菌、寄生虫、病毒等，尤其是近年来在全世界爆发的罗非鱼罗湖病毒，给行业造成巨大损失[11-14]。因此，研究罗非鱼机体抗病毒机制，对于将来罗非鱼疾病防治具有重要作用。本研究通过克隆获取罗非鱼基因全长，对在健康罗非鱼各组织的分布进行研究，对不同刺激物刺激后的表达特点进行分析，结果为进一步探究参与的机体免疫反应提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验所用健康尼罗罗非鱼购自高州市朗业养殖场，体质量约为50 g/尾。无乳链球菌（ZQ0910）菌种由广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室保存提供。PolyI:C购自Sigma公司；克隆载体pMD18-T Vector、rTaq、Premix Taq购自TaKaRa公司(大连)；Trans1-T1感受态细胞、RNA提取试剂盒、cDNA 合成试剂盒和qPCR试剂购自北京全式金生物技术有限公司；DNA 凝胶回收纯化试剂盒购自Thermo Fisher公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 罗非鱼总RNA的提取和cDNA的合成 罗非鱼在实验室条件下(28 ± 2) ℃暂养1周后，无菌条件下取皮肤、头肾、鳃、脑、体肾、肠、肌肉、心脏、肝、胸腺和脾11个组织，各取罗非鱼3尾，每尾鱼作为1个平行，放入2 mL冻存管中，液氮速冻后–80 ℃保存，用于基因克隆和用于不同组织表达分析。

对于刺激实验设置取样。无乳链球菌刺激组：腹腔注射浓度为1×107cfu/mL的无乳链球菌0.1 mL；polyI:C刺激组：腹腔注射浓度为100 μg/mL的polyI:C 0.1 mL；对照组：腹腔注射0.1 mL的磷酸缓冲液（PBS），分别在 0、3、6、12、24、48、72、96 h各取罗非鱼3尾，每尾鱼作为1个平行，取脾脏、体肾、头肾和肠道组织，放入 2 mL冻存管中，液氮中保存。根据 TransZol Up Plus RNA Kit说明书提取罗非鱼各组织RNA。按照北京全式金公司的 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix 说明书将提取到的罗非鱼各样本的总 RNA反转成 cDNA。

1.2.2 罗非鱼基因的克隆 依据本实验室罗非鱼转录组数据，结合NCBI上公布的罗非鱼基因组数据预测的基因序列，利用Primer 6.0设计On-ifi35基因引物（On-ifi35-1F：ATGATGCGCCTTTGTGTTTTTC）、（On-ifi35-1125R：TCACACTTTTCTGCTCTTTACTCTAGA），以1.2.1制备的罗非鱼脾脏cDNA为模板，然后进行PCR扩增，PCR 反应体系（20 μL）：Premix Taq 10 μL，ddH2O 7.5 μL，cDNA 模板0.5 μL，On-ifi35-1F 1 μL，On-ifi35-1026R 1 μL。PCR 反应条件设置为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，40个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃下保存。

PCR产物经10 mg/mL琼脂糖凝胶电泳检测合格后对其进行切胶回收，目的条带与pMD 18-T载体进行连接，转化至Trans1-T1感受态细胞中，加入1 mL LB液体培养基进行活化培养，然后离心浓缩细菌培养液至100 μL培养基中，将其均匀涂布于含100 ng/μL浓度Amp+的LB琼脂糖固体平板上，倒置在37 ℃恒温培养箱中培养8 ~10 h，挑选单菌落于含 Amp+的LB液体培养基中，于37 ℃、150 r/min 条件下培养3 ~ 5 h，用pMD 18-T载体上的通用引物（M13：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC；RV：GAGCGGATAACAATTTCACACAGGA）进行菌落 PCR鉴定，将阳性克隆送至生工生物公司测序。

1.2.3基因的生物信息学分析 对克隆获得的cDNA序列使用NCBI (https://blast. ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对分析；利用ExPASy ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/）进行On-ifi35氨基酸序列推导和相关理化性质分析；通过TMHMM Server 2.0 (http://www.cbs. dtu. dk/services/TMHMM)进行跨膜结构域预测；通过Inter ProScan Sequence search (http://www.ebi.ac.uk/Tools)和SMART(http:// smart.embl-heidelberg.de/)进行蛋白功能结构域分析；通过Clutalx和Genedoc软件进行氨基酸同源序列比对分析。通过MEGA6.0 软件，用邻接法构建系统进化树。

1.2.4 qRT-PCR检测的表达 qRT-PCR实验参考本实验室方法[15]。首先利用的特异性引物（On-ifi35-qF：TAACGGAAGAAAGGTGGC）、（On-ifi35-qR：GTGTTCCAGGTGGTATCG）。以为内参基因（β-actin-F: AACAACCACACACCACACATTTC，β-actin-R:TGTCTCCTTCATCGTTCCAGTTT），使用ABI 7500 Real-Time定量PCR仪检测在各个组织以及不同刺激后的表达分析。qPCR 参照TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒说明书进行，反应体系：TransStart Top Green qPCR SuperMix 5 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，cDNA 0.5 μL，dH2O 3.7 μL。反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，40个循环。每个样本设置3个复孔。用 2-ΔΔCt方法计算相对表达量。此外，在罗非鱼各组织中分布的检测中，把皮肤组织表达量作为1，各个组织的相对表达量=每个组织的表达量/皮肤组织的表达量。在刺激组中，各组织相应时间点的相对表达量=实验组各组织相应时间点的表达量/对照组织相应时间点的表达量。

2 结果

2.1 On-ifi35的序列特征

克隆获得的（GenBank 登录号: MF975639）基因全长为1 125 bp，可编码374个氨基酸，预测蛋白分子质量为42.79 ku，等电点为5.01。将On-ifi35基因与NCBI上基因组序列比对发现，On-ifi35基因组位于罗非鱼的第四号染色体上，由 10个外显子和9个内含子组成（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?LinkName=protein_gene&from_uid=348510241）。序列分析表明，On- ifi35 含有1个LZD结构域（19-36-43-53-66 aa）和2个NID结构域（162-249aa，261-347aa）（图 1）。利用ClustalW2 软件，将On-ifi35氨基酸序列与其它物种的ifi35氨基酸序列进行同源性比对，结果发现On-ifi35与其它物种的相似性在35.23% ~ 93.32%之间（图 2），其中On-ifi35与同是鲈形目慈鲷科的淡水鱼类斑马拟丽鱼同源性较高，而与高等哺乳动物鼠的ifi35同源性较低。利用 Mega 6.0软件的 Neighbor-Joining法构建系统进化树，结果显示哺乳动物与鱼类的ifi35聚为2个不同的分支，且罗非鱼的ifi35与斑马拟丽鱼的ifi35聚为1支，具有最近的亲缘关系（图 3）。

下划线表示LZD结构域（19-36-43-53-66 aa），灰色背景表示Nmi/IFP 35 结构域 (NID)（162-249 aa，261-347 aa）

GenBank 登录号 (accession numbers): O.niloticus XP_003442654.1; M.zebra XP_004552562.1; M.albus XP_020461212.1; O.latipes XP_023813097.1; L.crocea XP_010744566.3; O.mykiss XP_021414073.1; S.salar NP_001135293.1; H.sapiens XP_016880073.1; M.musculus NP_081596.1

图3 邻位相连法构建ifi35氨基酸系统进化树

2.4 On-ifi35在罗非鱼各组织中的分布

的各组织表达检测结果（图4）显示，在健康罗非鱼的11个组织中均能表达，且在脾脏组织中表达量最高，其次是胸腺、肝脏、心脏、肌肉、肠道、体肾、脑、鳃、头肾、在皮肤中表达量最低。

SK：皮肤；HK：头肾；G：鳃；B：脑；K：体肾；I：肠；M：肌肉；H：心脏；L：肝；T：胸腺；S：脾；On-ifi35在皮肤中的表达量设为1。

2.5 无乳链球菌刺激后On-ifi35在罗非鱼各组织中的表达

无乳链球菌刺激罗非鱼后，用qRT-PCR检测在脾脏、肠道、体肾和头肾等4个组织中的时序表达。结果如图5显示，在脾脏组织中的表达量呈现先升高再降低，最后恢复到正常水平的变化，其中3 h显著性增加(< 0.05)，而在24 h显著性降低(< 0.05)；在肠道和头肾组织中的表达量呈现先升高再降低的变化，其中在肠道组织中，3 h极显著增加(< 0.01)，12h显著性增加(< 0.05)；在头肾组织中，3 h和6 h均显著性增加(< 0.05)；在体肾组织中的表达量呈现先降低再升高的变化，其中，6 h、12 h和24 h均极显著降低< 0.05)。

2.6 PolyI:C刺激后On-ifi35在罗非鱼各组织中的表达

同样的，PolyI:C刺激罗非鱼后，用qRT-PCR检测在脾脏、肠道、体肾、头肾四个组织中的时序表达，结果如图6显示，的表达量均呈现先升高再降低，最后恢复到正常水平的变化，其中在脾脏组织3 h显著性增加(<0.05)，在肠道和头肾组织中，3 h和6 h都发生了极显著增加(<0.01)，在体肾组织中，3 h极显著增加(<0.05)。

*: 差异显著(< 0.05); **: 差异极显著(< 0.01)；在各个对照中的表达量均设为1

*: Significant difference (< 0.05); **: Very significant difference (< 0.01); Expression level of On-ifi35 in each control was set as 1

图5 无乳链球菌刺激后在不同组织的时序表达

Fig. 5 Expression analysis ofin different tissues after stimulated by

*: 差异显著(P < 0.05); **: 差异极显著(P < 0.01)；On-ifi35在各个对照中的表达量均设为1

3 讨论

本研究首先克隆获得的基因全长为1 125 bp，编码 374 个氨基酸，通过与NCBI上公布的基因组序列比对发现，位于罗非鱼的第四号染色体上，由10个外显子和9个内含子组成。且与高等哺乳动物人类ifi35相同，整个基因组中只有一个单拷贝[9]，暗示其功能在进化过程中未发生较大的扩张。序列分析表明，On-ifi35含有1个LZD结构域（19-36-43-53-66 aa）和2个NID结构域（162-249 aa，261-347 aa）。哺乳动物中，LZD结构域可促使bZIP转录因子二聚化，形成一个邻近富含碱性氨基酸的双边DNA结合区。NID大约由90 ~ 92个氨基酸构成，该结构域在每个蛋白质中串联重复，并介导NMI-NMI蛋白质相互作用和亚细胞定位[10]。罗非鱼ifi35同样具有保守的NID和LZD结构域，暗示ifi35从高等哺乳动物到低等脊椎动物鱼类的功能具有相似性。多序列比对显示，On-ifi35与同是鲈形目慈鲷科的淡水鱼类斑马拟丽鱼具有93.32 %的同源性，而与哺乳动物人和鼠同源性相对较低，但是重要结构域比较保守，系统进化树分析显示，罗非鱼的ifi35与斑马拟丽鱼的ifi35聚为1支，具有最近的亲缘关系（图 3）。综上所述，本研究所获得的罗非鱼ifi35是ifi35家族的一员。

人在不同细胞群如上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和角质形成细胞中均可表达。ifi35的同源物NMI，在许多被检测的细胞系中（来源于肝、肾、T细胞、B细胞、前列腺、子宫和宫颈的肿瘤）均可表达，且NMI蛋白的最高水平在胸腺、脾脏和肝脏[16]。目前在鱼类当中还未有表达的分析。本研究通过实时荧光定量PCR分析显示，在健康罗非鱼各组织中均有表达，其中在脾脏组织中表达量最高，其次是胸腺、肝脏、心脏、肌肉、肠道、体肾、脑、鳃、头肾，在皮肤中表达量最低。脾脏、胸腺组织作为罗非鱼重要的免疫器官，还有大量T细胞和B细胞，与哺乳动物的同源物NMI的分布类似。PolyI:C作为病毒类似物刺激鱼体后，机体会产生抗病毒的免疫反应[17]。而ifi35作为调节干扰素表达的关键分子，在机体应答外源物刺激后的表达特点还未有相关的文献报道。本研究发现，经无乳链球菌和PolyI:C刺激后，的表达量在罗非鱼的脾脏、肠道、体肾和头肾中均发生显著性变化且呈现出明显的时序性，此结果表明，在鱼体抵抗细菌和病毒感染过程中均可发挥一定作用。然而体肾组织作为鱼体的重要排泄器官，2种刺激物刺激后的表达模式呈现相反的时序依赖性，推测可能由于机体应对2种不同外源物质产生了不同的应答机制，但是具体原因需要进一步研究。

4 结论

本研究克隆获得基因全长序列，通过结构域分析、序列比对以及系统进化树分析表明，所获基因是ifi35家族成员。在健康罗非鱼各组织中均有表达，无乳链球菌和PolyI:C刺激罗非鱼后，在脾脏、肠道、体肾和头肾等4个组织中的表达量均呈现显著性变化。

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Cloning and Expression Analysis ofin Nile Tilapia ()

HUANG Yu1,2,3, MA Jia-lin1, ZHOU Mian-xin1, CHEN Min-qi1, CAI Jia1,2,3, JIAN Ji-chang1,2,3, TANG Ju-fen1,2,3

（1.// 2.// 3.,524088,）

To investigate the role of interferon induced protein 35 (ifi 35) in the immune response of.The open reading frame of tilapiagene (GenBank accession number: XM_003442606;) was cloned and the distribution ofin different tissues of healthy tilapia and stimulation with different stimuli was detected by real-time fluorescent quantitative PCR.gene is 1125 bp, encoding 374 amino acids, the theoretical molecular mass is 42.79 ku, and the isoelectric point is 5.01. On-ifi 35 contains one LZD domain and two Nmi/IFP 35 domain (NID). Multiple sequence alignment revealed that On-ifi 35 shared 35.2% - 93.3% sequence homology with ifi 35 from other species, and had the highest homology with. Phylogenetic analysis results indicate that On-ifi 35 was clustered with ifi 35 of the. Real-time quantitative PCR analysis showed thatwas expressed in all tissues of healthy tilapia. The highest expression was found in the spleen, followed by thymus, liver, heart, muscle, intestine, body kidney, brain, gill and head kidney. The lowest expression level was in the skin. After stimulation withagalactiae and PolyI:C, the expression level ofwas significantly changed in the spleen, intestine, mid-kidney and head kidney.

;; gene; cloning; expression

Q78；Q959.483

A

1673-9159（2020）02-0013-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.02.003

2019-08-15

国家自然科学基金(31572651)；广东省普通高校青年创新人才项目(230419083)

黄瑜（1986－），男，讲师，博士，研究方向为鱼类免疫学。 E-mail: huangyu@gdou.edu.cn

汤菊芬（1964－），女，高级工程师，硕士，研究方向为水产动物病害防治。E-mail：tjf10002000@163.com

黄瑜，马嘉霖，周棉鑫，等. 罗非鱼干扰素诱导蛋白35基因克隆及表达分析[J].广东海洋大学学报，2020，40（2）：13-19.

（责任编辑：刘岭）