Fe2+和Fe3+对长茎葡萄蕨藻生长、铁含量和生理特性的影响

王晓梁，刘东超，徐日升，陈海昇

Fe2+和Fe3+对长茎葡萄蕨藻生长、铁含量和生理特性的影响

王晓梁1,2，刘东超1,2，徐日升1,2，陈海昇1,2

（1. 广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；2. 广东省藻类养殖及应用工程技术中心，广东 湛江 524025）

【】探索两种无机铁对长茎葡萄蕨藻（）的生长、铁含量及生理特性的影响。分别以三氯化铁（FeCl3）和硫酸亚铁（FeSO4）作为铁源，采用单因素实验方法，研究在不同浓度Fe2+、Fe3+条件下，长茎葡萄蕨藻的生长、光合色素含量、铁含量、两种过氧化酶（CAT、T-SOD）活性，以及总蛋白、维生素C和可溶性糖含量。在水体中无论是添加Fe2+还是Fe3+，藻体的特定生长率（SGR）、光合色素含量、铁含量、过氧化物酶活性和维生素C含量均显著高于对照组（< 0.05）。藻体的铁含量随着培养液中铁离子浓度的升高而增加，以Fe2+和Fe3+处理后，藻体铁最高值分别可达到1 522.54 µg/g和1 373.93 µg/g，增幅为1 369.34%和1 225.92%；藻体维生素C最高质量分数分别可达15.41 µg/mg和12.89 µg/mg，增幅为107.56%和73.58%。Fe2+实验组对藻体的可溶性糖含量有显著影响（< 0.05）。实验藻体的总蛋白含量显著低于对照组（< 0.05）。藻体在3 mg/L Fe2+或者6 mg/L Fe3+的条件下，长茎葡萄蕨藻生长最佳，其营养品质可得以改善。

长茎葡萄蕨藻；生长；铁含量；抗氧化酶；营养成分

长茎葡萄蕨藻（），俗称海葡萄，是一种大型食用绿藻，主要生长在潮间带海区、水流较缓的沙地或礁石[1]。它不仅富含多种人体所需的氨基酸、维生素和矿物质等营养元素[2-4]，还含有多种活性成分，在治疗痛风、抗病毒与癌症等方面具有较高的医药价值[5-7]。

铁是人体的一种必需微量元素，主要在细胞代谢和氧的转运中发挥重要生理作用[8-9]。人体所需的铁主要通过食物链获取，而自然食物中铁含量通常不能满足人体需要。据统计，缺铁性贫血依旧是一个世界性的公共健康问题[10]，有必要在食物中补充铁来满足人体的生理需要，以蒸煮谷物植物为主食的人群更需补铁[11-12]。目前增加膳食中铁供给途径主要有直接补充、食物强化、饮食多样化、作物生物强化（包括育种与施肥）[11]。许多学者根据作物生物强化的原理开展了许多经济作物的富铁研究，而作为功能食品的藻类的消费不断增加[13]，因此研究开发富铁的藻类功能食品有重要价值。目前，关于食用藻类的富铁研究仅见钝顶螺旋藻（）和小球藻（）等微藻的报道[14-15]，而大型食用海藻类富铁研究鲜有报道。

长茎葡萄蕨藻为公众喜爱的一种高端生鲜美食。笔者研究Fe2+、Fe3+两种无机铁对长茎葡萄蕨藻的生长、富铁量和生理特性的影响，旨在为生产富铁的长茎葡萄蕨藻，开发新型长茎葡萄蕨藻功能食品提供参考。

1 材料与方法

1.1 长茎葡萄蕨藻藻种

实验用长茎葡萄蕨藻藻种购自深圳市蓝汀鼎执生物科技有限公司，培养于广东海洋大学水产学院藻类实验室。

暂养条件：温度（26±1）℃，照度（2 000±100）lx，光暗周期12 L：12 D，营养盐为0.5 mmol/L 的NaNO3溶液和0.1 mmol/L的KH2PO4溶液，海水盐度30±1，连续充气培养，换水周期为7 d[16]。

1.2 富铁实验设计

挑选长势良好的长茎葡萄蕨藻，剪取25 mm左右的直立枝作为实验对象，用干净海水反复冲洗后，将直立枝放入灭菌不加营养盐的海水中进行适应培养1 d。

实验用铁化合物为1 g/L FeCl3溶液、1 g/L FeSO4溶液。全部药品均为分析纯（AR）。

采用1.5 L的方形开口塑料盒作为培养盒，添加1 L过滤灭菌自然海水，分别加入1 mL的NaNO3溶液与1 mL的KH2PO4溶液作为营养盐。根据预实验结果，2种价态（Fe2+和Fe3+）的铁浓度分别设置为0（对照组）、3、6、9、12 mg/L。选取暂养后健康的直立枝，称取质量（0），随机分至各组，每组放置5棵直立枝，每个实验组设置3个平行组。

培养条件：不充气，其他条件与暂养条件一致。连续培养7 d，每天观测生长状况，7 d后取出。

1.3 指标测定

对培养结束后的藻体进行充分冲洗，去除表面的铁溶液，用吸水纸吸干表面水分，称取质量（m），计算藻体的特定生长率（SGR）[16]。

将藻体烘干，研磨制成藻粉，进行硝化，用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测其含铁量(Fe)[17]。

按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书要求，将藻体进行剪切、匀浆、稀释等，测其光合色素含量、过氧化氢酶（CAT）活力、总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力、总蛋白（TP）含量、维生素C（VC）含量和可溶性糖含量。

1.4 数据的处理和分析

SGR = [100 ln(m/0)] /；

Fe= (待测样浓度-空白浓度)测/测；

(Chl-a)=[13.95(665nm)-6.88(649nm)]测/测；

(Chl-b)=[24.96(649nm)-7.32(665nm)]测/测；

(类胡萝卜素) = {[1 000(470nm) - 2.05×(Chl-a) - 114.8(Chl-b)] / 245}测/测。

式中，SGR为特定生长率(%·d-1)，0为初始藻体质量(g)，m为最终藻体质量(g)；测为待测样硝化处理后的体积(L)，测为待测样的质量(g)。

总蛋白质量浓度= (待测OD值 -空白OD值) / (标准OD值-空白OD值) × 标准品质量浓度（0.524 g/L）× 稀释倍数，标准品质量浓度0.524 g/L，在= 595 nm处测量。

CAT活力= (对照OD值-测定OD值) × 271 × 1 /（60×取样量）/ 待测样本蛋白浓度，在= 405 nm处测量。

T-SOD活力= (对照OD值-测定OD值) / 对照OD值 / 50% ×（反应液总体积 / 取样量）/ 待测样本蛋白浓度，在= 550 nm处测量。

VC质量分数= (待测OD值-空白OD值) / (标准OD值 -空白OD值) × 标准品质量浓度× 稀释倍数(4倍) / 待测样本蛋白浓度，标准品质量浓度6 µg/mL，在= 536 nm处测量。

可溶性糖质量分数= (待测OD值 -空白OD值) /（标准OD值- 空白OD值）× 标准品质量浓度× 稀释倍数/ 待测样本蛋白浓度，标准品质量浓度100 µg/mL，在= 620 nm处测量。

采用IBM SPSS Statistics 19软件对数据进行处理和分析。通过单因素方差分析和Duncan多重比较对数据进行显著性检测（< 0.05），每组浓度结果，按照三组均值±标准误用GraphPad Prism制图。

2 结果与分析

2.1 两种无机铁对长茎葡萄蕨藻SGR的影响

两种无机铁对长茎葡萄蕨藻SGR的影响见图1。图1可见，随着Fe2+或Fe3+浓度的升高，长茎葡萄蕨藻的特定生长率均呈先升后降变化趋势。当Fe2+质量浓度为3 mg/L时，长茎葡萄蕨藻的特定生长率最大，为4.670%·d-1，Fe3+质量浓度为6 mg/L时，藻体SGR最大，为5.627%·d-1，且均与对照组（2.746 %·d-1）有显著差异（< 0.05）。

可见，在实验浓度范围内，无论添加Fe2+还是Fe3+，均可促进长茎葡萄蕨藻的生长。最适添加的Fe2+质量浓度为3 mg/L，Fe3+质量浓度为6 mg/L。

凡含有一个相同字母则组间差异无统计学意义（P>0.05）

2.2 两种无机铁对长茎葡萄蕨藻光合色素的影响

图2可见，所有加铁实验组的藻体叶绿素a含量均高于对照组，差异有统计学意义（< 0.05）；铁浓度变化对藻体叶绿素b含量影响不显著（> 0.05）；所有加铁组藻体的类胡萝卜素含量均值均高于对照组，但在Fe2+实验组中仅3 mg/L和6 mg/L两组差异有统计学意义（< 0.05），在Fe3+中，除9 mg/L外，其余3组藻体的类胡萝卜素含量均与对照组差异有统计学意义（< 0.05）。

可见，两种无机铁主要对长茎葡萄蕨藻叶绿素a和类胡萝卜素的含量变化有显著影响，对叶绿素b含量影响不显著。

2.3 两种无机铁对长茎葡萄蕨藻富铁量的影响

两种无机铁对长茎葡萄蕨藻富铁量的影响见表1。表1可见，随着铁离子浓度的升高，长茎葡萄蕨藻的富铁量呈升高趋势，与对照组差异有统计学意义（< 0.05）。当添加Fe2+时，除6 mg/L和9 mg/L两组之间差异无统计学意义（> 0.05）外，其他各组间差异有统计学意义（< 0.05），在12 mg/L时，藻体富铁量达到最高值，为1 522.540 µg/g，各组增幅分别为528.80%、901.71%、1 080.21%、1 369.34%。当添加Fe3+时，各组间差异有统计学意义（< 0.05），在12 mg/L时，藻体富铁量达到最高值，为1 373.932 µg/L，各组增幅分别为402.06%、581.89%、903.08%、1225.92%。

综合分析，在实验浓度范围内，长茎葡萄蕨藻对两种价态的铁均有较强的富集能力。在相同浓度下，Fe2+实验组比Fe3+实验组的藻体富铁量略高。

凡含有一个相同字母则组间差异无统计学意义（>0.05）

The date with a same letter indicate no significant difference between them (> 0.05)

图2不同的无机铁浓度下长茎葡萄蕨藻光合色素含量变化

Fig.2 Changes of photosynthetic pigments content inunder different concentrations of inorganic iron

表1 不同的无机铁浓度下长茎葡萄蕨藻富铁量

注：凡含有一个相同字母则组间差异无统计学意义（>0.05）

Note: The date with a same letter indicate no significant difference between them (> 0.05)

2.4 两种无机铁对长茎葡萄蕨藻抗氧化酶CAT、T-SOD活力的影响

两种无机铁对长茎葡萄蕨藻抗氧化酶CAT、T-SOD活力的影响见图3。图3可见，Fe2+处理组的藻体CAT活性显著高于对照组（< 0.05）。Fe3+处理组，除3 mg/L组别外，其余处理组藻体的CAT活性显著高于对照组（0.05）。在图3-B中，Fe2+处理组的藻体T-SOD活性均与对照组差异有统计学意义（<0.05），Fe3+的处理组，除3 mg/L组外，其余处理组藻体T-SOD活性均显著高于对照组（<0.05）。可见，在实验浓度范围内，除3 mg/L 的Fe3+外，添加两种无机铁可显著提高藻体两种抗氧化酶活力，且当添加Fe2+浓度为3 mg/L时，两种抗氧化酶活力最强；当Fe3+浓度为6 mg/L时，藻体的两种抗氧化酶活力开始相对稳定。

凡含有一个相同字母则组间差异无统计学意义（>0.05）

The date with a same letter indicate no significant difference between them (> 0.05)

图3不同无机铁浓度下长茎葡萄蕨藻过氧化物酶活力变化

Fig.3 Changes of peroxidase activity inunder different concentrations of inorganic iron

2.5 两种无机铁对长茎葡萄蕨藻总蛋白、VC和可溶性糖含量的影响

两种无机铁对长茎葡萄蕨藻总蛋白、VC和可溶性糖含量的影响见表2。表2可见，所有加铁组的藻体总蛋白含量均显著低于对照组（<0.05）。在Fe2+处理后，各实验组的藻体总蛋白含量比对照组分别降幅为36.47%、17.88%、31.82%、33.37%。在Fe3+处理后，各实验组的藻体总蛋白含量分别降幅为18.65%、34.15%、38.80%、30.27%。在Fe2+处理后，添加浓度为3 mg/L和9 mg/L组的VC含量与对照组相比显著提高（<0.05），分别增幅107.56 %和128.55 %。而Fe3+处理组中，除3 mg/L组外，其他组均与对照组有显著提高（<0.05），分别增幅52.68%、73.58%、71.21%。Fe2+处理后，藻体可溶性糖含量均显著增加（<0.05），增幅分别为39.01%、5.87%、23.02%、25.12%。Fe3+处理后的藻体可溶性糖含量没有显著提高（>0.05）。

可见，Fe2+和Fe3+处理组的藻体总蛋白含量均显著低于对照组。Fe2+处理后的藻体的VC与可溶性糖含量总体上显著提高。Fe3+处理组的藻体的VC含量总体上显著高于对照组，但藻体的可溶性糖含量与对照组差异不大。

表2 不同的无机铁浓度下长茎葡萄蕨藻的总蛋白、VC和可溶性糖含量变化

凡含有一个相同字母则组间差异无统计学意义（>0.05）。

The date with a same letter indicate no significant difference between them (> 0.05).

3 讨论

3.1 两种无机铁对长茎葡萄蕨藻生长和光合色素的影响

铁是藻类生长所必需的重要微量元素，同时也是限制性因素之一，在细胞呼吸、叶绿素产物合成以及作为辅酶参与电子和氧的转运等过程中发挥作用[18-21]。在培养液中适当增加铁的浓度可促进小球藻（）、铜藻（）的生长[15, 22]。本研究表明，无论是添加Fe2+还是Fe3+，均可促进长茎葡萄蕨藻的生长，说明在天然海水中加铁可有效促进长茎葡萄蕨藻的生长。最适宜的Fe2+质量浓度为3 mg/L，Fe3+质量浓度为6 mg/L。不同价态铁的最适浓度不同，主要是因为藻类对两种价态铁离子的吸收机制不同，藻类可直接吸收利用外界环境中的Fe2+，仅小部分Fe3+可通过硫置换途径进入细胞，大部分需经置换和蛋白转运两个过程方可被吸收利用[23-25]。在光合色素的生成途径中，需要以铁卟啉环和δ-氨基-γ-酮戊二酸（ALA）为原料，铁离子是二者生成原料之一，因此铁可通过影响这两种物质的生成而影响光合色素的产生，从而导致色素含量发生变化[26]。研究表明，海带（）幼孢子体的叶绿素a和类胡萝卜素含量随着培养液中铁浓度的增加而显著增加[27]，铜绿微囊藻（）和慧氏微囊藻（）叶绿素a和类胡萝卜素的含量在富铁培养液中明显高于缺铁的环境[28]。本研究中，添加两种无机铁主要对长茎葡萄蕨藻叶绿素a和类胡萝卜素含量有显著影响，但对叶绿素b含量无显著影响。

3.2 两种无机铁对长茎葡萄蕨藻富铁量的影响

一般而言，在植物耐受范围内，植物对微量元素的富集量会随环境中微量元素的升高而增加。目前已成功培育出多种富铁陆生植物，在食用藻类富铁强化方面亦培育出富铁螺旋藻（1 426.40 µg/g，干基）、富铁蛋白核小球藻（995.17 µg/g，干基）[14-15]。野生海藻铁含量取决于沿岸海域中铁离子含量，并呈季节性和地理性的变化[13]。关于天然长茎葡萄蕨藻中铁含量，唐贤明等[29]报道约为136.96 µg/g（干基），de Gaillande[9]报道为0.2 ~ 214 mg/kg（干基）。本研究中，测得对照组藻体铁质量分数为103.62 µg/g，加入铁后，藻体铁含量随培养液中Fe2+或Fe3+浓度的升高而增加，最高值分别可达1 522.54 µg/g和1373.93µg/g，增幅为1 369.34%和1 225.92%，表明长茎葡萄蕨藻对两种价态的铁均有较强的富集能力，应用无机铁强化藻体铁含量来生产富铁功能海藻是可行的。在相同浓度下，Fe2+处理组的富铁量高于Fe3+处理组，是藻类对两种价态铁的吸收转运机制不同所致，Fe2+具有更快的时效性[30]。

3.3 两种无机铁对长茎葡萄蕨藻类抗氧化酶CAT、T-SOD活力的影响

T-SOD和CAT是两种典型的抗氧化酶，它们通过将体内形成的超氧化物转换成毒性小或者无害物质减少对植物造成的毒性损伤[31]。T-SOD在植物中主要以Mn-SOD、CuZn-SOD和Fe-SOD三种形式存在[32-33]，大多数真核藻类的叶绿体基质中，Fe-SOD占主导地位。T-SOD通过控制金属离子的得失电子对超氧化物阴离子自由基进行歧化来维持藻类细胞的稳定[34-35]。CAT是以铁卟啉为辅基的结合酶，可将T-SOD酶产生的H2O2转化为水。因此，在铁元素充足状况下，藻类体内代谢旺盛，两种酶活力较高，以分解代谢产生的毒害物质[36-37]。本研究中，在Fe2+溶液培养条件下，两种酶活力出现先升后降，再上升的现象，是因为藻体吸收铁离子后会产生自由基，部分自由基一定程度上可抑制铁对藻体的迫害，但当铁离子浓度持续增加时，藻体产生的大量自由基又会对机体产生伤害，导致酶活力上升，以减少对藻体的迫[38]；在Fe3+溶液培养条件下，两种酶活力表现为先升高后平稳，这是因为藻体对不同价态铁的利用机制不同[39]。从本研究可知，在实验铁浓度范围内（0 ~ 12 mg/L），T-SOD和CAT保护作用基本与铁浓度存在正相关性。当添加的Fe2+质量浓度为3 mg/L，藻体的两种酶的活性最高；当Fe3+浓度质量达6 mg/L后，藻体T-SOD和CAT的活性随Fe3+浓度升高相对稳定，这时藻体的生长也最佳。

3.4 两种无机铁对长茎葡萄蕨藻总蛋白、VC和可溶性糖含量的影响

蛋白质、VC和可溶性糖是衡量藻类营养质量的三个重要指标。研究发现，当外界生长环境改变时，藻类的生长及生理生化成分也会随之改变。加入铁后，藻类外界环境改变，藻体易受胁迫而导致蛋白质的改变[40]。本研究中，两种加铁实验组的蛋白质含量低于对照组，这与Xing等[41]报道的铁使紫背浮萍（）蛋白质合成受到严重抑制的结果相似。这可能是因为藻体对铁环境产生了胁迫反应，使藻体中叶绿素蛋白质合成受抑制，从而导致总蛋白减少[40]，或者是因为藻体铁蛋白达到了一定的值后，铁对其他种类蛋白质合成和表达产生了负面影响从而降低了总蛋白含量[42]。实验组VC含量发生变化，是因为VC是一种抗氧化剂，在铁环境下细胞内活性氧（ROS）含量改变，作为清除过量ROS的优势抗氧化剂，VC会随ROS的变化而变化[43]。可溶性糖是植物体内重要供能物质，也是一种信号传递物质，对植物生长、增殖等过程有调控作用[44]。本研究中，加铁组可溶性糖的含量均高于实验组，说明铁促进植物生长，在生长过程中植物进行光合作用产生大量的碳水化合物，从而导致可溶性糖的含量升高[45-46]。

总的来说，在加铁环境下，藻体除蛋白质含量降低外，VC和可溶性糖含量均显著增加，说明添加铁可较好地改善长茎葡萄蕨藻的营养品质，尤其是VC含量的显著增加将有助于人体对铁的吸收[12]。

4 结论

在培养海水中分别加入两种无机铁（Fe2+、Fe3+）后，藻体的特定生长率、光合色素含量、铁含量、两种过氧化酶（CAT、T-SOD）活性以及总蛋白、维生素C、可溶性糖含量均受到影响。综合考虑各指标，藻体在添加的Fe2+浓度为3 mg/L或Fe3+浓度为6 mg/L时，长茎葡萄蕨藻不仅获得最佳的生长，而且可较好地改善其营养品质。因此，最适宜添加的Fe2+浓度为3 mg/L，最适宜的Fe3+浓度为6 mg/L。

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Effects of Two Types of Inorganic Iron on the Growth, Iron Content and Physiological Characteristics of

WANG Xiao-liang1,2, LIU Dong-chao1,2, XU Ri-sheng1,2, CHEN Hai-sheng1,2

（1.,524088,; 2.,524025,）

【】The effects of two types of inorganic ferrum on the growth, photosynthetic pigment, iron content, antioxidative enzymes activity and nutrient components of.【】Ferric chloride (FeCl3) and ferrous sulfate (FeSO4) were added as iron sources in diet and their effects on growth, photosynthetic pigment content, iron content, enzymatic activity (CAT, T-SOD) and total protein, Vitamin C and soluble sugar content ofwere studied in a single factor experiment.【】The specific growth rate, photosynthetic pigment concentration, iron content, antioxidative enzymes activity (CAT, T-SOD) and Vitamin C concentration of algae were significantly higher than the control group under Fe2+or Fe3+treatment (<0.05). The iron content of algae is significantly increased with the increase of Fe2+or Fe3+concentration in the culture solution with the highest values 1 522.54 µg/g and 1 373.93 µg/g respectively and the increase was by 1 369.34% and 1 225.92%respectively. The highest Vitamin C concentration of algae reached 15.41 µg/mg (for Fe2+) and 12.89 µg/mg (for Fe3+), increasing by 107.56% and 73.586%,respectively. Fe2+group had a significant effect on the soluble sugar content of algae (<0.05). The total protein content of algae was significantly lower than that of the control group (<0.05). 【】When the algae was under 3 mg/L Fe2+or 6 mg/L Fe3+treatment, the algae achieved the best growth and improvement in nutritional quality.

; growth; iron content; antioxidative enzymes; nutrient content

S968.4

A

1673-9159（2020）02-0020-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.02.004

2019-12-02

广东省科技计划项目（2015A020209167）

王晓梁（1993－），男，硕士，主要从事藻类生理生态学研究。E-mail:544517970@qq.com

刘东超（1963－），男，副教授，主要从事藻类生理生态学研究。E-mail: dongchaoliu696@hotmail.com

王晓梁，刘东超，徐日升，等. Fe2+和Fe3+对长茎葡萄蕨藻生长、铁含量和生理特性的影响[J]. 广东海洋大学学报，2020，40（2）：20-27.

（责任编辑：刘庆颖）