混合藻体溶液中藻体浓度检测方法优化的研究

冯唐锴++江雪++王炳山++蔡新安++张耀++付金梅

摘 要：文章试图联用分光光度法和干重法，优化水中混合藻体生物量的检测方法，为自然水域混合藻体生物量监控提供有效措施。文章主要研究了混合藻体溶液可见光最大吸收峰值波长的测定方法、沉降时间对藻体溶液吸光值的影响，以及初步建立了混合藻体溶液“吸光值-干重”相关性的线性方程。

关键词：分光光度法；藻体；浓度；干重；吸光值

中图分类号：X832 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2017）20-0020-02

前言

大量有害藻体在水中堆积生长并死亡后，会产生有害藻毒素、降低水的氧容量、散发硫化氢等有毒气体给水体带来异味、细菌大量繁殖、水生动植物死亡、甚至产生致癌物危害水体安全[1]。因此，污水中藻体含量的检测对水体富营养化污染监控有重要意义。水体藻类生物量检测的基本方法有分光光度法、干重法、细胞计数法等[2]。目前水中藻类生物量检测的研究，多使用单一藻类为研究对象。但天然水体中是混合藻体，因此单一藻类检测结果并不见得适用于自然水体中藻类含量的检测。有文章[3]提到使用改良的细胞计数法测定自然水体中混合藻类的生物量。受此启发，本文设计实验了分光光度法配合干重法探索溶液中混合藻体生物量的检测方法，希望利用这种检测方法能够更加快速便捷的检测自然水体中总藻的含量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 混合藻體溶液的配置

本文所用的含混合藻体的水样是从景德镇学院生物与园林实训基地的蓄水池中取得的水样，将该水样接种至人工藻体培养液进行扩大培养，然后经过高盐除虫、蒸馏水清洗并浓缩富集后，将藻体浓缩液储藏于5℃冰箱中，供后续实验按需取用。

1.1.2 仪器与设备

752sp型紫外分光光度计，GZX-9140 MBE型电热鼓风干燥箱，BSA223S型电子天平，SHB-III型循环水式多用真空泵、ZD-85恒温振荡器、直径7.0cm定性滤纸，SB-348A曝气增氧装置、海尔BCD-186KB型冰箱、HCMJQ-100B型高压灭菌锅。布氏漏斗、塑料藻体培养容器、日光灯、蒸馏水及烧杯、试管、玻璃棒等其他实验室常用玻璃器皿。

1.2 方法

1.2.1 混合藻体的取样、放大培养和浓缩保存

含有混合藻体的水样取自景德镇学院生物与园林实训基地蓄水池。取500ml水样接种至10L本课题组人工配置的藻体培养液中，白天自然光辅助日光灯照明，24h曝气不间断连续培养。每周向培养体系中补充人工培养液500ml。每两周从培养容器底部收集藻体，并转移至200ml高盐溶液（近饱和盐水），常温（25℃左右）振荡处理1天，除虫抑菌。高盐处理后，抽滤藻体溶液，滤纸上的藻体转入500ml蒸馏水清洗，震荡2天充分除盐，再次抽滤后的藻体转至500ml高温高压消毒蒸馏水中。多次重复收集藻体，5℃冰箱冷藏备用。

1.2.2 吸光值-藻体质量相关性曲线的建立

（1）混合藻体溶液吸收波峰的研究

取少量藻体，在蒸馏水中配制两种任意浓度的藻体溶液，混匀后直接取样粗测不同波长可见光的吸光值，检测波长分别设置为420nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm。

结果显示样品在450nm～500nm之间有最大吸收峰值。进一步在420nm～520nm处每隔10nm对样品溶液进行精测，结果显示，混合藻体溶液的可见光吸收峰值在480nm～490nm范围内。

（2）沉降时间与吸光值的关系研究

任意配制三种不同浓度的混合藻体溶液，混匀后对三个样品分别测定吸光值。取2ml溶液置于分光光度计比色皿中检测485nm波长光吸收，每隔1min测定一次，记录吸光值数据，作图分析。

（3）藻体溶液吸光值-藻体干重相关性曲线的建立

藻体溶液吸光值与其所含藻体干重相关性的研究分两步进行：

a.取少量混合藻体，晾干后配制成200ml藻体溶液（浓度设定为C），混匀。取100ml、50ml、25ml、12.5ml藻体溶液，后三份溶液皆定容为100ml，故其浓度分别被稀释为0.5C，0.25C，0.125C，摇匀，静置10min。测定四个混合藻体溶液样品的吸光值，作图分析。

b.按照由少到多的规律，随机取少量浓缩混合藻体，晾干后配制成50ml混合藻体溶液，合计11个样品，分别测定其吸光值及所含藻体干重，作图分析。

每个样品溶液所含藻体干重的测定方法：从配置好的50ml藻体溶液中取2ml样品检测吸光值，测定完毕后将加入比色皿的2ml藻体溶液回收，与其余48ml溶液合并。比色皿中残留的藻体用蒸馏水冲洗3次，清洗液一并并入原50ml藻体溶液。取一张抽滤滤纸，烘干（于恒温干燥箱中60℃烘2小时），尽量去除水分，称取重量（g1）。利用该滤纸进行抽滤。抽滤过程中倒入藻体溶液时应尽量缓慢，溶液接触滤纸的位置应该位于滤纸的中央，尽量防止溶液溅出至滤纸外，降低误差。将带有藻体的滤纸自然晾干后，从布氏漏斗中取出，烘干（于恒温干燥箱中60℃烘2小时），称重（g2）。即得藻体干重g=g2-g1。

2 结果与分析

混合藻体溶液中藻体的生物量与其所含光合色素的量通常会具有正相关性，光合色素的量与其吸光值的大小通常也具有正相关性。因此可利用分光光度计测定藻体溶液光合色素（主要为叶绿素a）的光吸收情况，从而间接反应溶液中藻体的浓度大小[4、5]。不同藻类细胞中所含光合色素的种类和数量不同，不同色素对不同波长的光吸收情况不同，因此混合藻体与单一色素甚至单一藻体相比，其对光吸收的峰值对应的波长肯定都不会相同。因此，本文首先对混合藻体溶液的光吸收峰值对应的波长进行了研究。

2.1 混合藻体溶液最大吸收峰值对应波长位置的研究

2.1.1 粗测混合藻体溶液最大吸收峰值对应波长大小

本文首先对两个不同浓度的藻体溶液样品在420nm～700nm波段可见光区的吸光度进行了检测，测出每隔50nm波长间距的混合藻体光吸收情况。根据该数据作混合藻体溶液在不同波长吸光值的变化趋势图，可以发现，最强吸收峰在500nm左右。

2.1.2 精测混合藻体溶液最大吸收峰值对应波长的大小

根据粗测结果，缩小范围，在420nm～520nm波段处每隔10nm对上述两个样品溶液进一步精测并作不同浓度混合藻体溶液在不同波长的吸光值变化趋势图。可以发现，本研究中两个不同浓度混合藻体溶液的最大吸收峰皆位于480nm～490nm之间。但是由于两个样品的浓度有一定区别，测定过程中存在误差，所以两条曲线的最高峰值并未完全重合。因此，折中选取485nm作为后续实验的吸光值检测波长。

2.2 沉降时间与吸光值的关系

在上述实验进行中发现，对新配制混匀的藻体溶液立即检测吸光值，同一样品用于多次检测得到的数据不同，随着时间推移数据呈逐渐减小趋势。本文据此配制了三个不同浓度的混合藻体溶液，测定其不同沉降时间条件下485nm处的吸光值并作不同浓度混合藻体溶液在不同沉降时间测定的吸光值变化趋势图。我们发现，三个样品的检测结果显示了相似的变化趋势，即不同浓度的样品在前5min每隔1min检测，吸光值呈下降趋势。但是5min以后，三个样品的吸光值先后趋于稳定，且不同样品吸光值大小关系不随时间改变。因此，测定混合藻体溶液吸光值前，应先将配制好的待测样品静置一段时间，待其溶液达到平衡状态以后，再行检测。静置五分钟后三个样品溶液的吸光值就已趋于稳定，但是考虑到随着藻体浓度进一步提高，可能静置五分钟仍不够。故后续实验都选择在配制混匀混合藻体溶液后静置10min再开始检测。

2.3 混合藻体溶液浓度、藻体干重与吸光值相关性研究

为了测定混合藻体溶液藻体生物量与吸光值的关系，本文选取了不同浓度的样品，研究混合藻体溶液在485nm处吸光值的变化情况。

2.3.1 混合藻体浓度与其吸光值变化关系研究

通过测定某混合藻体溶液（浓度以C表示）及其成倍稀释溶液（浓度分别为C/2，C/4，C/8）485nm处的吸光值。根据该数据作藻体浓度与吸光值相关性变化趋势图，可以看出该混合藻体溶液吸光值大小与其浓度成正比线性关系。

2.3.2 混合藻体溶液吸光值与其所含藻体干重相关性的研究

本文进一步对11个不同浓度的混合藻体溶液进行检测，测得其藻体溶液485nm吸光值与其所含藻体干重数据。根据该数据，做混合藻体溶液吸光值与其藻体干重的相关性变化趋势图（图1），并生成回归直线方程。从图中可以看出，吸光值与藻体干重也具有正比关系，所有数据皆围绕回归直线呈正态分布。生成的线性方程为：

Y=0.6216X+0.0200，R2=0.9187

其中，Y为吸光值大小，X为溶液中藻体干重，R为y的期望值。

3 结束语

本文利用分光光度法，建立了一套鉴定水中藻体含量的方法。该方法可在除藻抑藻工作中，作为检测除藻抑藻效果的重要方法。但是在研究中存在一些不足，需要改进和提高，主要包括以下几个方面：

3.1 不同水体需测定不同的最大可见光吸收峰值波长

本文测定的最大吸收峰值波长适用于本研究样本来源的水体，但是不见得适用于其他水体。因此，在测定不同水体吸光值时，建议都应重新确定其光吸收峰值对应的波长大小。鉴于此，我们还应进一步研究天然水体与利用该水体接种后人工培养的混合藻体溶液在藻体种类和数量上是否存在较大差异，这种差异也可能对“吸光值-藻体干重”回归直线和方程的建立及应用产生一定的影响。

3.2 混合藻体溶液“吸光值-干重”相关性回归曲线及方程需要进一步完善

本文建立的混合藻体溶液“吸光值-干重”相关性回归直线及方程的准确性和精确度有待进一步提高。主要问题在于：（1）测定藻体干重的方法仍有改进空间；（2）取得的有效数据数量较少，因此形成的回归直线和方程的代表性不足。在今后的研究中，我们将进一步优化检测方法，补充实验数据，以形成更加完善的天然水体混合藻类浓度的检测方法。

参考文献：

[1]王家玲，李顺鹏，黄正.环境微生物学[M].第二版.北京：高教出版社，2004：372-382.

[2]黄美玲，何庆，黄建荣，等.小球藻生物量的快速测定技术研究[J].河北渔业，2010，196（4）：1-3.

[3]王瓚，乔俊莲，王国强，等.浓缩过滤-超声振荡法检测水中藻类[J].中国给水排水，2008，24（14）：86-87.

[4]段刚，刘晓海，高云涛，等.分光光度法测定滇池藻类生长的研究[J].化学与生物工程，2006（23）：4，55-57.

[5]陈晨，马晓雁，李军，等.水中典型致臭藻类培养浓度与吸光度、浊度关系探讨[J].四川环境，2010，29（4）：31-34.