不同地理种源北柴胡种子性状及植株生长分析

戚文涛， 李剑超， 王晨， 罗容,2， 刘长利,2*

(1.首都医科大学中医药学院，北京 100069；2.首都医科大学中医络病研究北京重点实验室，北京 100069)

伞形科柴胡属(BupleurumL.)植物主要分布在北半球温带、亚热带地区，约2 500种，《中国植物志》记载我国共有41种17变种7变型，其中药用25种[1-3]。柴胡作为我国传统中药材，具有和解表里、疏肝解郁、升阳举气功效。《中国药典》规定柴胡为伞形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)和狭叶柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld.)的干燥根，习称“北柴胡”和“南柴胡”[3]。目前，柴胡已被中国和日本纳入国家药典，同时中国和韩国将其列为常用药用植物，因其重要的药用价值，柴胡需求量急剧增加，人工种植是解决需求的必然选择[4-6]。北柴胡作为柴胡药材的主要来源，在我国东北、华北、华中及华南等地均有分布，并且在大部分地区已有引种栽培，在甘肃、陕西、山西、河南及黑龙江等地形成家种产区。由于人工引种来源广而复杂，各个种源地自然环境差异显著，种植技术和管理模式各不相同，致使北柴胡种子成活率较低，药材性状差别较大、质量不稳定和药效不可控，严重影响了柴胡的临床用药安全和疗效，所以加强不同种源地北柴胡种子种苗及植株药材研究，规范北柴胡引种、栽培和药材加工迫在眉睫。

中药质量控制和提升是促进中医药传承创新发展的关键，其中规范中药材种子种苗和种植技术是基础，也是中医药行业面临的主要难题。目前，针对北柴胡种子储藏条件、萌发特性、栽培方法及组织培养等已有大量研究报道[6-11]，对不同产地中药材种子种苗及植株药材差异比较也有相关报道，如杨旭等[12]对不同产地43份桔梗种子地理变异、种子特性及幼苗生长状况进行分析，发现安徽亳州及安徽太和的桔梗种源适合在浙江富阳等地区栽培；童应鹏等[13]对中国8省9产地栽培薏苡种子性状变异原因进行了分析和研究，但迄今为止，对不同种源北柴胡种子的质量评价及引种后植株适应性研究还少有报道。本文对不同种源北柴胡种子性状及植株生长状况进行研究，揭示地理、气候等生态环境因子对北柴胡种子特性和植株生长状况影响，为北柴胡优质种源筛选、规范引种栽培提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料(表1)于2018年3月至5月收集于北京、黑龙江大庆、河南洛阳、四川绵阳、山东济南等7省区10个产地，其中，中柴2号(B13)和川北柴1号(B14)均为当地选育品种。经首都医科大学中医药学院刘长利副教授鉴定为植物柴胡(B.chinense)双悬果的分果(种子)。所有材料种植于山东省济南市曹范镇柴胡种植基地，2019年7月23日采收。

表1 供试北柴胡种子产地基本情况Table 1 Basic information on the origin of B. chinense seeds

1.2 试验方法

1.2.1DNA提取及PCR扩增 供试种子样品用75%酒精棉擦拭表面，挑选籽粒饱满的种子10粒约10 mg，置于2.0 mL 离心管中，于液氮中冷冻干燥，用混合型球磨仪研磨1 min(36 00 r·min-1)，利用新型植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取样品基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，引物为ITS2F：5’-A T G C G A T A C T T G G T G T G A AT-3’；ITS2R：5’-G A C G C T T C T C C A G A C T A C A AT-3’。PCR扩增体系20 μL，包括2× KAPA HiFi HotStart ReadyMix酶(美国Kapa Biosystems公司) 10.0 μL，正向引物和反向引物各 0.6 μL，基因组DNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。扩增程序为95 ℃变性3 min；98 ℃变性20 s；55 ℃退火15 s；72 ℃ 延伸20 s；35个循环；72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离检测，由北京睿博兴科生物技术有限公司进行双向测序。

1.2.2种子性状指标测定 随机选取每批供试种子样品30粒，用体视显微镜(SteREO Discovery.V8，ZEISS)以及游标卡尺(电子数显卡尺，LINKS)进行测量和观察，记录供试种子的颜色、形状及长、宽、厚等特征，并拍照；精密称取供试种子样品4 g，捡出净种子、杂质及其他植物种子，重复操作3次，分别计算样品的净度；取每份供试样品种子各500粒，精密称其重量，重复3次，计算种子样品千粒重；采用高温烘干减重法进行种子样品含水量测定，先将样品盒(铝盒)烘干(130 ℃，1 h)，放入干燥器中冷却30 min。从充分混匀的北柴胡种子样品中随机称取2份种子(5.0 g·份-1)，再将样品盒连同种子进行烘干(130 ℃，1.5 h)，待铝盒冷却后称量，并根据烘干后种子失去的重量计算种子含水量。

含水量=(减少的重量/供试种子的重量)×100%

1.2.3植株性状指标测定 采收不同产地的柴胡植株15株，测量植株的株高、茎粗(上、中、下部)、根粗、根长及根的干重等指标，并观察记录植株的外观性状，包括叶、茎及根等特征。

1.2.4数据处理 对种子样品ITS2序列用SeqMan7.0软件进行剪切和拼接，去除引物及低质量区，并基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法，去除两端5.8 S和28 S 区段即可获得核糖体DNA内部转录间隔区2(ITS2)间隔区序列，并从GenBank数据库中下载柴胡属包括北柴胡在内的其他种ITS2序列，对所有ITS2序列用MEGA7.0进行多重序列比对并利用邻接法(neighbour-joining，NJ)构建系统进化树，进一步鉴定收集种子样品的基原。

1.2.5数据分析 用Excel表建立北柴胡种子和植株的数据文档，并用SPSS 19.0软件进行方差分析、种子及植株性状与生态环境因子的相关性分析(北京和四川绵阳均为选育品种，排除二者后进行相关性分析)，并采用欧式距离法对中国7省区10产地的北柴胡种子进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同种源北柴胡种子性状比较分析

从图1可以看出，不同种源的北柴胡种子外观特征相似，果实均为双悬果，颜色为棕褐色或棕黑色，顶端花柱基宿存，基部圆钝；分果(种子)呈卵形、矩圆形或椭圆形，两端压扁，背部略拱凸，向合生面弯曲，表面有5条主棱(中间背棱1条，两边侧棱各1条，两侧棱和背棱间各有中棱1条)，棱槽处有纵皱纹，合生面中央有果柄痕。不同产地北柴胡种子的形态指标均存在显著性差异(P<0.05，表2)。北京选育的北柴胡品种中柴2号(B13)和四川绵阳的川北柴1号(B14)相较于其他种源地的北柴胡种子均比较长且宽，千粒重较大；其次为山东济南的北柴胡种子，千粒重较大，种子较长且宽；千粒重最小的为甘肃天水北柴胡种子。种子长宽比结果对比发现，山东济南北柴胡种子比值最大，比较细长，黑龙江大庆产种子比值最小，均比较短宽。，山东莱芜产地的北柴胡种子含水量最大，黑龙江大庆产地的种子含水量最小。不同种源地的北柴胡种子均或多或少掺有杂质或其他种子，影响种子的纯度和质量。

表2 不同种源北柴胡种子性状多重比较Table 2 Multiple comparisons of B. chinense seed traits

图1 部分北柴胡种子和对应植株生长性状Fig.1 Morphologica characteristics of partial B.chinense seeds and plants

2.2 种子性状与生态环境因子相关性分析

对北柴胡种子的外观性状与产地的地理、气候等生态环境因子的相关性分析表明(表4)，种子的宽度、厚度及千粒重与经度呈显著正相关，与纬度的相关性不显著，排除降水量和温度差的影响，经度越高，宽度和厚度越大，种子的千粒重越大，相关系数分别达到0.753、0.666和0.633；种子的含水量与产地的年降雨量呈显著正相关，降雨量越大则种子的含水量越高，相关系数达到0.745。

2.3 不同种源北柴胡植株生长状况比较

对植株的株高、根茎等指标进行进行方差分析表明，植株高度、茎(下、中、上)粗、根直径、根干重及根长均存在显著性差异(P<0.05，表3)。对植株外观性状观察发现，山东济南产地北柴胡基部茎多分3～8枝且叶片较宽长，其他产地北柴胡多为茎单一且叶片较狭长；选育品种川北柴1号(B14)和中柴2号(B13)的植株颜色较其他产地深，呈现深绿色，且培育品种的花期和果期较其他产地较早，二者植株7月份均结出成熟的双悬果，部分产地植株还处于花蕾期。从表3可以看出，河南三门峡和陕西商洛产地北柴胡植株比较粗高，选育品种植株相对比较矮小；山东济南产北柴胡主根粗大且长，根茎的干重相对于其他产地要高很多，推测其为试验田本地品种更适宜生长，生长年份较其他产地长所致，其次为黑龙江大庆产地和中柴2号植株的根茎比较粗大且较重，且三个产地的根茎侧根均较多。

表3 不同种源北柴胡植株生长状况多重比较Table 3 Multiple comparisons of growth status of different B. chinense

2.4 北柴胡植株性状与生态环境因子相关性分析

对北柴胡植株性状与产地的地理、气候等生态环境因子的相关性分析(表4)表明，植株的茎粗细与纬度呈显著正相关，纬度越高，植株的茎则较粗，相关系数达到0.638和0.779；根茎干重与年均日照呈显著正相关，日照越长，根茎干重则越重，说明日照有助于植株根茎生长和代谢产物积累，相关系数达到0.641。

表4 北柴胡种子性状、植株性状与地理生态因子相关系数Table 4 Correlation coefficient between B.chinense seed/plant traits and geographical ecological factors

2.5 北柴胡种子质量与植株生长状况的相关性分析

北柴胡种子千粒重与其长、宽、厚呈显著正相关，相关系数分别为0.707、0.771和0.701，说明长宽厚均比较大的种子其千粒重越大。种子千粒重与根长、根干重呈显著正相关，相关系数分别为0.711和0.643, 说明千粒重较高的种子含有丰富的营养物质，可为幼苗根茎生长提供更多营养，从而影响植株的根茎生长，根茎较长且干重较大。北柴胡植株的高度、茎粗与根茎的长度、干重有一定的相关性(P<0.05)，植株越粗大，分枝越多，其光合作用效率越强，对根生长影响就越显著。根茎质量与根长的相关性极显著，相关系数为0.856(P<0.01)，而与根茎直径的相关性则并不显著，说明北柴胡的根系在生长发育期间主要完成向下生长过程，其直径增加将在纵向生长过程完成后进行。

2.6 不同产地北柴胡聚类分析

2.6.1ITS2序列聚类分析 基于北柴胡种子的ITS2序列构建NJ系统聚类树(图2)。从聚类树上可以明显看出，伞形科防风、当归和柴胡属其他物种分别单独聚类，说明它们与柴胡属物种的亲缘关系较远易区分；柴胡属内5个物种单独聚为5小支，且各分支支持率较高，具有良好的单系性，供试的13批北柴胡种子均聚在北柴胡一支，进一步说明其均为北柴胡种子。

2.6.2欧氏距离聚类分析 根据北柴胡种子千粒重、含水量、长度、宽度、厚度、种子长宽比及植株的株高、根直径、根长、根干重10个指标，采用欧式距离法对中国的7省区10个地区的北柴胡种子进行聚类分析，结果见图3。从图3可知，10产地的栽培北柴胡种子可以聚为4类，中西部地区的甘肃定西、甘肃天水、陕西商洛、河南三门峡及河南洛阳聚为一类，东北地区的黑龙江大庆聚为一类，中东部地区的山东济南、山东莱芜聚为一类，选育品种的北京和四川绵阳聚为一类。中西部地区的北柴胡种子植株较高，主根较短且干重小，种子千粒重居中；东北地区北柴胡种子千粒重较小，植株较长且干重较大；中东部地区北柴胡种子较大，千粒重较大，植株根系发达，较长且分枝较多；北京和四川绵阳均为选育品种，种子较大且均匀，千粒重均较大，植株较矮小，主根较长，但根茎的干重差别较大，这与川北柴1号生长环境有关，在北方地区生长有一定影响。

图3 不同种源北柴胡(欧氏距离)聚类分析Fig.3 Cluster of B.chinense (Euclidean distance) from different locations

2.6.3两种聚类分析结果比较 对比NJ树聚类和欧式距离聚类结果可知，ITS2序列系统进化树可以准确鉴别种子或植株的基原，但不可以对产地和性状进行区分；欧式距离聚类分析则可以根据种子或植株的性状特征进行产地区分，但不能直接反映出种子或植株的基原。

注： B1、B3等为北柴胡种子,编号同表1。Note：B1 and B3 etc. are code of B.chinense seed as Table 1.图2 ITS2序列NJ系统进化树Fig.2 NJ tree based on the ITS sequences

3 讨论

3.1 不同种源地北柴胡种子和植株性状的显著差异性

不同种源北柴胡种子虽然外观特征极其相似，但是形态和性状指标均存在显著性差异，说明我国北柴胡种子性状存在较大的变异，遗传信息丰富。选育品种中柴2号(B14)和川北柴1号(B14)籽粒饱满，净度较高，种子千粒重较大，质量优于其他产地北柴胡种子。对其他非选育北柴胡种子研究发现，山东济南的北柴胡种子比较细长且千粒重最大，黑龙江大庆产北柴胡种子较短宽且千粒重最小；不同产地的北柴胡种子中均或多或少掺有杂质或其他种子，且种子大小和饱满度不一，影响种子纯度和质量。研究发现，北柴胡种子的长、宽、厚及千粒重等指标的变化主要是由于经度的改变，随着经度的升高，海拔逐渐减低，降水量等因子逐渐增加，种子含水量也逐渐增加。

不同种源北柴胡植株地上部分和地下部分的生长表现出显著性差异。其中山东济南产地北柴胡基部茎多分3～8枝且叶片较宽长，其他产地北柴胡多为单一茎且叶片狭长；川北柴1号和中柴2号等选育品种的植株呈现深绿色，二者的花果期较其他产地较早。北柴胡植株茎的直径很大程度上是由纬度的改变引起，随着纬度的降低，热量因子逐渐增加，温度逐渐升高。根茎干重则受产地年均日照的影响，日照越长，干重越大。因此在北柴胡栽培引种时，应按照引种地的实际地理气候情况，尽量选择生态环境因子相近的地区作种源区进行引种，以保证引种后北柴胡种子有较高的成活率和良好的生长状况。

3.2 影响北柴胡种子性状差异的因素

相关分析表明，北柴胡种子性状和质量受产地生态环境因子的影响，呈现显著性差异。我国柴胡资源分布广泛，相关研究发现，我国药用柴胡来源多达25种8变种3变型，包括北柴胡的变种烟台柴胡(B.chinenseDC. f.vanheurckii(Muell. -Arg.)和百花山柴胡(B.chinenseDC. f.octoradiatum(Bunge)等[14]，北柴胡丰富的遗传信息和遗传多样性影响种子和植株的性状资源[15-16]。同时，各地栽培北柴胡的品种多是从山谷中野生资源引种、驯化、选育出来，在逐步迁移、驯化和选择过程中，人为筛选出许多地方品种，各地栽培密度，播种时间及灌溉施肥等方式也各不相同，造成了北柴胡种子和植株的性状差异。以上结果表明，北柴胡种子性状受产地生态环境因子、遗传信息和人工栽培方法等因素的影响。