流式微球分析技术在区别活动性结核分枝杆菌与潜伏性结核分枝杆菌感染患者中的应用

陶芃作

（1.中南大学湘雅三医院 医学检验系，湖南 长沙；2.中南大学湘雅医学院 医学检验系，湖南 长沙）

0 引言

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是结核病的主要致病因子，是最具影响力的人类病原体之一，每年感染大约860万人，导致130万人死亡[1,2]。因此，确定潜伏性结核分枝杆菌感染是必要的，以降低疾病发展的风险，而活动性结核病的诊断可以实现快速治疗和疾病控制[3]。为此，需要能够准确指示疾病状态的诊断生物标志物。结核分枝杆菌感染会引起患者血清中细胞因子水平的变化[4]。然而，不同的研究选择了不同的细胞因子来检测活动性结核病，而对于所选细胞因子诊断活动性结核病的可靠性知之甚少[5,6]。因此，细胞因子反应的临床相关性仍有待阐明。流式微球分析技术（cytometric bead array, CBA）能够同时测量样品体积中的多种分析物，包括炎性介质，趋化因子，免疫球蛋白同种型，细胞内信号分子，凋亡介质，粘附分子和抗体[7]。基于此，本研究旨在应用流式微球分析技术区别活动性结核分枝杆菌与潜伏性结核分枝杆菌感染患者。

1 材料与方法

1.1 一般资料

纳入2016年3月至2019年3月我院收治的活动性结核分枝杆菌感染患者80例为活动组；其中，男41例，女39例；年龄18～72岁，平均年龄（33.95±14.29）岁。纳入2016年3月至2019年3月我院收治的潜伏性结核分枝杆菌感染患者80例为活动组；其中，男33例，女47例；年龄14～71岁，平均年龄（36.17±11.49）岁。80例活动性结核分枝杆菌感染患者与80例潜伏性结核分枝杆菌感染患者均经我院病理科确证。排除标准：①严重心、肝、肾功能损害者；②长期使用皮质类固醇激素及免疫抑制剂者；③患有精神疾病者；④患有癌症者。同时，纳入2016年3月至2019年3月至我院体检的健康体检者80例为对照组；年龄19～70岁；平均年龄（35.19±12.13）岁。各组一般资料比较差异均无统计学意义（P＞0.05），可纳入此次分析。受试者均签署知情同意书。

1.2 流式微球分析技术

采取活动性结核分枝杆菌感染患者80例、潜伏性结核分枝杆菌感染患者80例和健康体检者80例的肘前静脉血6mL，使用美国BD公司的商业化流式微球分析技术（cytometric bead array）检测患者血清中细胞因子EGF, GM-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-1RA,IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-17, MIP-1α, TNF-β, VEGF, IL-5, MIP-1β, Eotaxin, G-CSF,IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, TNF-α的表达水平。

1.3 统计学分析

PRISM 7.0软件进行统计分析，两组间比较采用t检验，三组间比较采用ANOVA检验。应用受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）分析Eotaxin, G-CSF, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1,TNF-α检测活动性结核分枝杆菌与潜伏性结核分枝杆菌感染患者的临床诊断价值。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3组受试人员的一般资料

对照组、潜伏组和活动组在年龄上无显著差异（P＞0.05）。对照组、潜伏组和活动组男女比例分别为35/45、33/47、41/39，分别有41名（51.25%），71名（88.75%）和49名（61.25%）受试者中存在卡介苗。对于QFT-GIT测定，所有非结核杆菌感染对照的结果均为阴性; 在45名（56，25%）潜伏组受试者和80名（100.00%）活动组受试者中观察到阳性结果。见表1。

表1 3组受试人员的一般资料

2.2 3组受试人员血清中细胞因子的表达量

在流式微球分析技术检测的27种细胞因子中，EGF(P=0.0530, F=2.973), GM-CSF(P=0.1136, F=2.195), IL-1α(P=0.0617, F=2.818), IL-1β(P=0.5837, F=0.5397), IL-1RA(P=0.6576, F=0.4199), IL-2(P=0.0948, F=2.38), IL-3(P=0.5414, F=0.6151), IL-4(P=0.2407, F=1.433), IL-7(P=0.0749,F=2.62), IL-10(P=0.8843, F=0.123), IL-12p40(P=0.5781,F=0.5492), IL-12p70(P=0.7985, F=0.2252), IL-13(P=0.1683,F=1.796), IL-15(P=0.6286, F=0.4651), IL-17(P=0.4597,F=0.7798), MIP-1α(P=0.5714, F=0.561), TNF-β(P=0.3029,F=1.2), VEGF(P=0.7584, F=0.2768)在健康体检者、活动性结核分枝杆菌感染患者与潜伏性结核分枝杆菌感染患者中无明显差异，IL-5(P＜0.0001, t=6.589)和MIP-1β(P=0.0090, t=2.634)在 健 康体检者与结核杆菌感染患者中有显著差异，但是IL-5(P=0.1217,t=1.556)和MIP-1β(P=0.7383, t=0.3347)在活动性结核分枝杆菌感染患者与潜伏性结核分枝杆菌感染患者中无明显差异，Eotaxin(P＜0.0001, F=993.4), G-CSF(P＜0.0001, F=5397), IL-6(P＜0.0001, F=154.2), IL-8(P＜0.0001, F=64), IP-10(P＜0.0001,F=25.29), MCP-1(P＜0.0001, F=12.27), TNF-α(P＜0.0001,F=73.33)在健康体检者、活动性结核分枝杆菌感染患者与潜伏性结核分枝杆菌感染患者中均存在明显差异，见表2。

表3 活动性结核分枝杆菌感染患者与潜伏性结核分枝杆菌感染患者血清中Eotaxin, G-CSF, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, TNF-α的AUC、灵敏度、特异度和约登指数

表2 3组受试人员血清中细胞因子的表达量

2.3 流式微球分析技术检测活动性结核分枝杆菌

感染患者与潜伏性结核分枝杆菌感染患者血清中Eotaxin,G-CSF, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, TNF-α的ROC曲 线、AUC、灵敏度、特异度和约登指数Eotaxin, G-CSF, IL-6, IL-8, IP-10,MCP-1, TNF-α的ROC曲线下面积分别为0.81±0.04（95%CI 0.7484～0.8894）、0.84±0.03（95%CI 0.7829～0.9131）、0.90±0.02（95%CI 0.7699～0.9023）、0.88±0.02（95%CI 0.8312～0.9457）、0.87±0.03（95%CI 0.819～0.9388）、0.77±0.03（95%CI 0.7032～0.8468）、0.92±0.02（95%CI 0.8732 to 0.9718），其 阳 性 临界值分别为309.6(pg/mL)、500.8(pg/mL)、279.2(pg/mL)、3490(pg/mL)、4048(pg/mL)、4724 (pg/mL)、159.7(pg/mL)，其诊断灵敏度和特异度分别为为82%和84%、83%和86%、83%和86%、85%和84%、90%和90%、89%和88%、81%和63%、93%和92%。见图1和表3。

图1 活动性结核分枝杆菌感染患者与潜伏性结核分枝杆菌感染患者血清中Eotaxin, G-CSF, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, TNF-α的ROC

3 讨论

结核病的发病率和死亡率很高[8,9]。尽管大多数感染结核分枝杆菌的人仍然健康，但这种状态被称为潜伏性结核感染。其中约占10%的个体最终会发展为活动性结核病[10-12]。快速诊断检测的开发，可以区分活动性结核病和潜伏性结核感染或活动性结核病和非活动性结核病对于结核病控制非常重要。结核分枝杆菌感染的诊断没有金标准，直到最近，结核菌素皮肤试验（TST）才是检测潜伏性结核感染的唯一工具[13]。然而，TST本质上无法区分活动性结核分枝杆菌和潜伏性结核分枝杆菌[14]。为了解决这些局限性，本研究引入流式微球分析技术来区别活动性结核分枝杆菌与潜伏性结核分枝杆菌感染患者。

本研究采用美国BD公司的流式微球分析技术检测患者血清中细胞因子的表达水平，比较其在健康体检者、活动性结核分枝杆菌感染患者与潜伏性结核分枝杆菌感染患者的差异后，通过ROC曲线分析发现Eotaxin, G-CSF, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, TNF-α的的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.81、0.84、0.83、0.88、0.87、0.77、0.92。相比于传统的测量患者血清中蛋白质水平的技术，流式微球分析技术有以下优点[15]：（1）允许以定量方式同时测量多种分析物; （2）减少用于测量多种分析物的样品量; （3）最大限度地减少生成数据所花费的时间。因此，本研究所发现的活动性结核分枝杆菌感染患者与潜伏性结核分枝杆菌感染患者血清中表达差异细胞因子Eotaxin, G-CSF, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, TNF-α可以通过流式微球分析技术一次同时测定，并且能够快速得到数据，这为Eotaxin, G-CSF, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, TNF-α中的一种或多种联合诊断活动性结核分枝杆菌感染与潜伏性结核分枝杆菌感染提供了技术基础。