孕期体重增加对孕晚期孕妇肠道菌群变化及母儿预后的影响

许雅娟，张婧喆，张淼，孙宗宗，班彦杰，王彪，侯晓峰，蔡琰钧，李晶晶

（郑州大学第三附属医院，河南 郑州）

0 引言

随着生活水平的提高及对孕期营养认识的不足，孕期体重增加过多孕妇日益增多。孕期体重增加过多对母儿预后有着深远影响，如增加妊娠期并发症发生率，增加巨大儿发生率、胎粪吸入综合征、新生儿高胆红素血症、儿童代谢综合征及儿童肥胖等风险[1-3]。近年来，肠道菌群在代谢性疾病中的调控作用逐渐成为人们关注的热点。大量研究表明，肠道菌群稳态通过参与宿主脂质、碳水化合物等营养代谢影响体重和能量平衡，并作为免疫系统成熟的关键刺激因素，减少感染和炎症反应[4-5]。有研究表明，孕期体重增加过多者肠道菌群变化显著[6]。但孕期体重增加过多具体与何种肠道菌群相关的研究仍较少，本研究对不同孕期体重增加水平的孕晚期孕妇肠道菌群进行物种差异分析及母儿预后比较分析，并对差异物种进行qPCR验证，旨在为保障母儿健康、改善妊娠结局提供新思路。

1 资料与方法

1.1 基本资料

本研究选取2017年9月至2018年1月于郑州大学第三附属医院足月待产的符合纳入及排除标准的孕妇61例。本研究经郑州大学第三附属医院伦理委员会审核批准，所有患者均自愿参加，并签署知情同意书。纳入标准：（1）孕晚期时在该医院待产的孕妇；（2）孕周≥37周（根据末次月经推算）。排除标准：（1）伴有严重的心肺、血液系统、高血压等慢性疾病者；（2）接受过肠道手术者；（3）近1月内腹泻或合并消化道慢性病史者；（4）孕期患有合并症和并发症者；（5）长期服用抗菌药物或激素类药物者；（6）孕期进行抗生素治疗者，孕期服用酸奶、益生菌及活菌类药物2周以上者；（7）双胎妊娠及以上者；（8）严重焦虑、抑郁或有认知功能障碍者；（9）辅助生殖技术妊娠者；（10）大便常规检查异常者。根据2009年美国医学研究院 (institute of medicine，IOM)孕期体重增加指南[7]，将纳入的61例孕妇分为：孕期体重增加不足（N=9），孕期体重增加适宜（N=22），孕期体重增加过多（N=30）。因孕期体重增加不足的数量较少，我们将孕期体重增加不足孕妇和孕期体重增加适宜孕妇合并为非孕期体重增加过多组（Non-Excessive GWG，N=31），并将其与孕期体重增加过多组（Excessive GWG，N=30）进行比较。

1.2 数据收集

粪便样本的采集在医院进行，简言之，粪便样本采集：用无菌勺采集受试者的新鲜粪便置于20mL冻存管内后置入液氮罐中，然后转入-80℃冰柜中保存，直至进行DNA提取、16SrRNA基因测序及qPCR验证（DNA提取、16SrRNA基因测序及qPCR均由华大基因科技有限公司提供）。

一般人口社会学资料：调取受试孕妇住院期间病历，获得孕妇的一般社会学资料，包括分娩时年龄、学历、身高、孕前体重、孕期体重增加、分娩孕周、孕次、产次、分娩方式、新生儿体重、新生儿Apgar评分等。分娩时年龄是根据中华人民共和国身份证号码计算的。

1.3 生物信息学分析

利用软件USEARCH（v7.0.1090）[8]将测序序列聚类为OTU（操作分类单元），并通过RDP classifer（v2.2）软件与数据库Greengene_2013_5_99比对，进行物种注释，置信度阈值设置为0.5。qPCR反应体系由16ul的反应体系组成，包括95℃预变性2min；94℃变性10s；60℃退火10s；72℃延伸40s。共40个循环。反应在ABI ViiA 7 PCR仪上进行。

1.4 统计分析

孕妇一般社会学资料采用卡方和维尔克森秩和检验（wilcoxon rank sum Test）检验两组数据是否有差异。本研究所使用的分析软件为SPSS 24.0版和R 3.1.1版。

孕妇肠道菌群组成与差异分析采用LEfSe多级物种差异判别。从门到属水平上区别Non-Excessive GWG和Excessive GWG两组孕妇孕晚期肠道菌群丰度的差异。该软件首先利用Kruskal-Wallis秩和检验找到具有显著丰度差异的物种。最后采用线性判别分析（LDA）来估算每个组分（物种）丰度对差异效果影响的大小，LDA sore分值越高，丰度越高，影响越大。

为了检查差异物种的绝对和相对定量之间的数据一致性，分别从Non-Excessive GWG组和Excessive GWG组中随机抽取5个样本对差异物种进行qPCR验证，qPCR反应在ABI ViiA 7 PCR仪上对384孔板中进行每个样本做三次平行实验。反应中的CT值数据的采集采用校正的阈值设定，绝对定量分析设置标准品的拷贝数，制作标准曲线后可直接生成样品的拷贝数。

2 结果

2.1 孕妇基本情况及母儿预后

本研究共纳入61个孕晚期孕妇，根据美国IOM推荐的孕期增重标准，分为Non-Excessive GWG 组（N=31）与Excessive GWG组（N=30）。两组孕妇在年龄、孕次、产次、分娩孕周方面无显著性差异。但Excessive GWG组孕妇受教育水平低于Non-Excessive GWG 组，而且Excessive GWG组孕妇剖宫产率高于Non-Excessive GWG组。新生儿预后方面，Excessive GWG组孕妇新生儿体重及巨大儿比例均高于Non-Excessive GWG 组，而且1分钟 Apgar评分低于Non-Excessive GWG 组（表1）。

2.2 测序序列

61个粪便样本测序共得到2 535 467条序列，677个OUT。Good's coverage 为 99.64%，表明粪便样本测序深度足够，本次测序结果可以代表样本的真实情况。

2.3 肠道菌群组成与差异

Non-ExcessiveGWG组与Excessive GWG组孕妇的肠道菌群组成（图1），在门水平上按照相对丰度从高到低，依次是厚壁菌门Firmicutes（62.03%；68.84%）、拟杆菌门Bacteroidetes（16.31%；12.56%）、变形菌门Proteobacteria（11.34%；9.20%）、放线菌门Actinobacteria（8.17%；8.28%）。

通过LEfSe物种差异判别（图2）显示，Excessive GWG组中Firmicutes较多，其中Clostridium_celatum丰度最高，其丰度明显高于Non-ExcessiveGWG组。

图1 Non-ExcessiveGWG组与Excessive GWG组群落组成（门水平）

2.4 qPCR

表2为Non-ExcessiveGWG组与Excessive GWG组粪便样本中Firmicutes qPCR结果。对比可发现:Excessive GWG组孕妇肠道中Firmicutes菌量明显高于Non-ExcessiveGWG组，与LEfSe物种差异判别结果一致。

表1 Non-Excessive GWG和Excessive GWG两组孕妇及其新生儿的对比情况

图2 LEfSe多级物种差异判别结果

表2 qPCR定量结果

3 讨论与结论

由于社会经济的发展，以及生活方式、饮食结构和环境的改变，孕期体重增加过多的现象也日益严重，许多孕期并发症和不良妊娠结局与肥胖密切相关。大量研究表明，肥胖会导致妊娠期高血压、流产、早产、胎儿窘迫、巨大儿等并发症[9-11]。我们的研究中发现孕期体重增加过多孕妇剖宫产率增加，其新生儿体重、巨大儿比例均高于非孕期体重增加过多孕妇，而且发现孕期体重增加过多孕妇受教育水平低于非孕期体重增加过多孕妇，且其新生儿1分钟 Apgar评分低于非孕期体重增加过多孕妇，因此孕期维持适宜体重增加意义重大。

作为人体内最复杂的共生微生物生态系统，肠道菌群的种群数量最高，因此人体的生理代谢特性在健康或者疾病状态下都会受到肠道菌群结构变化的影响。2004年，美国华盛顿大学的Gordon研究组首次提出肠道菌群作为一种环境因素调节脂肪贮存的观点，他们从调节能量代谢平衡的角度解释了肠道菌群参与肥胖、2型糖尿病发生、发展的机制[12]。随后，肠道菌群与肥胖相关性的研究日益受到人们的关注，但关于肠道菌群与孕期体重增加的研究仍较少，近几年的研究中，GOMEZ等[13]通过研究超重孕妇与肥胖孕妇之间肠道菌群的差异性发现，肥胖者厚壁菌门、放线菌门丰度较超重者升高，而超重者无壁菌门相对丰度升高。王颖楠等[14]同样发现肥胖孕妇肠道菌群中厚壁菌门比例上升，拟杆菌门比例下降，这与GOMEZ的结论一致。我们的研究发现孕期体重增加过多孕妇肠道菌群中厚壁菌门（Firmicutes）明显增多，且我们进行的qPCR定量验证也证实了这一结果。因此，维持孕期适宜体重增加，保持肠道菌群稳态，可能成为保障母儿健康的一个新的出发点。

本研究通过分析61个孕晚期孕妇一般社会学资料及其肠道菌群，得到的结果为：孕期体重增加过多孕妇受教育水平及其新生儿1分钟Apgar评分低于非孕期体重增加过多孕妇，其剖宫产率、新生儿体重及巨大儿比例均高于非孕期体重增加过多孕妇。且孕期体重增加过多孕妇肠道菌群中Firmicutes明显增多。孕期维持适宜体重增加，将对维持肠道稳态，改善母婴结局起到重要作用。