新疆库尔勒地区羊源产志贺毒素大肠杆菌及其耐药性分析

刘英玉, 朱明月, 苏晓月, 胥兰, 刘俊飞, 郑晓风, 张妍, 郑晓琴

(新疆农业大学动物医学学院, 乌鲁木齐 830052)

产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producingEscherichiacoli，STEC)是一类新发高致病性食源性病原菌，携带了前噬菌体编码的一种或两种志贺毒素基因，可引起人类水样腹泻、出血性肠炎及溶血性尿毒症等疾病[1-2]。前期研究主要是血清型O157∶H7大肠杆菌，但目前许多国家非O157大肠杆菌的流行已超过O157大肠杆菌[3]。STEC毒力基因编码许多毒力基因，志贺毒素(Shiga toxin，stx)是最主要的毒力基因。国际社会将stx列入生物武器核查清单之一，stx是潜在的生物毒素战剂和生物恐怖病原[4]。在大肠杆菌中具有溶解致死作用的是stx，前噬菌体编码的stx基因插入到大肠杆菌染色体基因组中，前噬菌体具有转导能力，使受体菌获得了志贺毒素的能力，stx家族研究最多的主要是stx1和stx2两种[5]。粘附素(eae)是仅次于stx,具有极强致病力的毒力因子，由LEE毒力岛编码，能使细菌黏附于宿主细胞膜[6]。肠溶血素(hly)是一种溶血素，可造成宿主多种类型细胞的细胞膜损伤，诱导产生炎症细胞因子[7]。

大肠杆菌耐药性的报道越来越多，胡彬等[8]报道了山东省部分地区23株猪源非O157 STEC菌株对磺胺异唑和复方磺胺异唑、萘啶酸、氯霉素、四环素等抗生素耐药率比较高。其主要原因是用药过程中抗菌药物的滥用和不合理使用，使细菌的耐药性不断增加，并且多重耐药问题更加突出。耐药的大肠杆菌对家畜的健康产生危害，还可通过环境的污染影响家畜健康，从而对人类的健康产生威胁[9]。新疆是我国五大牧区之一，牛、羊养殖业是新疆现代畜牧业发展的主导产业。牛、羊等反刍动物是STEC的贮存宿主，国际相关研究发现其携带率可高达71%以上，STEC感染人导致的疾病也越来越多，引起世界广泛关注，前期已报道新疆牛源中STEC的污染情况[1]。新疆库尔勒是发展“丝绸之路”的枢纽地区，本研究选取新疆库尔勒地区的羊产业链，对屠宰场的肉样和胴体拭子、市场的肉样和加工用具拭子、养殖场的肛拭子等样品进行STEC的分离鉴定，检测STEC中毒力基因情况和抗生素的耐药情况，以期为新疆地区羊源STEC的污染监测提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1菌株 STEC O157∶H7 CICC21530标准菌株由新疆农业大学动物医学学院况玲教授提供。

样品信息：2017年春季库尔勒定点屠宰场样品肉样和胴体拭子各19份和32份，2017年春季库尔勒农贸市场肉样、工具拭子及胴体拭子各20份和26份；2018年春季在库尔勒市郊区某规模化养殖场的两个育肥场采集肛拭子各86份和63份，繁殖场采集肛拭子36份，共计采集肛拭子185份。羊肉生产环节合计282份样品。

1.1.2试剂 LB肉汤、伊红美兰琼脂、麦康凯培养基、Mueller-Hinton培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司；TaqMaster Mix、DNA Marker 2000、琼脂糖、EZ-Vision DNA染料购自新疆宝信生物有限公司；革兰氏阴性杆菌药敏试剂盒均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.3仪器 YJ-875医用净化工作台购于苏州净化设备公司，THZ-02型台式恒温振荡器购于中国科学院新疆分院科学仪器厂，电热恒温培养箱购于上海一恒科学仪器有限公司，LDZX-50KB型立式压力蒸汽灭菌锅购于上海申安医疗器械厂，Bio-rad T100梯度PCR仪、移液器、高速离心机均购于德国Eppendorf公司，制冰机购于日本三洋有限公司，电子天平购于梅特勒-托利多仪器有限公司，凝胶成像仪购于美国伯乐公司，水平电泳槽和DYY-6C型电泳仪购于北京六一仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1菌株的分离和鉴定 拭子样品中大肠杆菌的分离鉴定：取拭子样品置于5 mL LB肉汤中，37 ℃培养18～24 h，划线于伊红美兰琼脂上，观察琼脂上的紫红色金属光泽菌落后，挑取单菌落划线于麦康凯琼脂上纯化，并对单菌落采用革兰氏染色法进行镜检，将鉴定完成的菌株挑取单菌在LB肉汤中培养18～24 h后，用30%甘油进行保菌备用。

肉样中大肠杆菌的分离鉴定：按照《GB/T4789.3-2016食品卫生微生物学检验——大肠菌群计数》[10]检验方法中规定的肉样处理方法进行分离，同时挑取具有典型大肠杆菌特征的单菌落用革兰氏染色法镜检，将鉴定纯化的单菌落于LB肉汤中培养18～24 h后，用30%甘油进行保菌备用。

1.2.2PCR检测 ①PCR扩增引物。引物参考Bai等[11]的stx等毒力基因引物设计方法，由上海生物工程服务有限公司合成(表1)，引物的使用浓度10 μmol·L-1。

表1 PCR引物序列和扩增长度Table 1 PCR primer sequence and amplification length

②PCR检测方法。采用煮沸法制备细菌DNA模板，离心后收集上清[12]。

PCR检测反应体系：共25 μL，TaqMaster Mix 10 μL，引物各1 μL，细菌DNA模板2 μL，ddH2O 11.4 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34个循环；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存产物。

③琼脂糖凝胶电泳。配制1%琼脂糖凝胶，取8 μL PCR产物进行电泳检测，采用凝胶成像系统进行观察并扫描保存。

1.2.3药敏纸片检测 以大肠杆菌ATCC 25922为质控菌株，对STEC进行17种常用抗生素的药物敏感试验，结果依照CLSI判定标准进行判定。革兰氏阴性杆菌药敏试剂盒中的17种抗生素分别为：卡那霉素、氧氟沙星、哌拉西林、麦迪霉素、氨苄西林、氨曲南、链霉素、妥布霉素、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他啶、头孢西叮、头孢噻吩、头孢噻呋、头孢曲松、头孢唑林。用酶标仪测定STEC菌液浓度，将菌液浓度稀释至OD600值为0.08左右。一个Mueller-Hinton培养基平皿上面用1 000 μL菌液，用灭菌的涂布棒将培养基上面的菌液均匀涂开，用灭菌的镊子取药敏片，一个平皿贴6片药敏片，液体干后倒置放于温箱中,37 ℃培养24 h后观察结果。

1.3 数据处理

采用 Excel 2013软件整理分析数据。

2 结果与分析

2.1 羊肉产业链中不同来源样品的STEC分离鉴定结果

对羊肉产业链中的282份样品进行STEC分离鉴定，结果如表2所示，共检出72株STEC(肉样有2株、胴体拭子有1株、肛拭子有69株)，检出率为22.8%。2017年春季库尔勒屠宰场中肉样19份未检测出STEC；而胴体拭子32份中只检测出1株STEC，分离率为3.1%。2017年春季库尔勒市场中肉样20份检测出2株STEC，分离率为10.0%；而加工用具拭子26份均未检测出STEC。2018年春季库尔勒羊养殖场中育肥场一86份样品检测出20株STEC，分离率为23.3%；育肥场二63份样品检测出25株STEC，分离率为39.7%；繁育场36份样品检测出24株STEC，分离率为66.7%。

2.2 羊肉产业链中STEC毒力基因的检测结果

对分离鉴定的STEC进行毒力基因的PCR检测，检测结果见表2。毒力基因以stx1+hly的形式最为常见，其次是stx1+stx2+hly的形式。分别统计STEC菌株毒力基因stx1+stx2、stx1、stx2、rfbE、eae、hly的检出个数为23、47、2、0、6、4、53个。养殖场中stx以stx1为主，检出率达到了65.2%(45/69)，72株STEC菌株均为非O157菌株。育肥场一20株STEC中毒力基因stx1+stx2有4个，stx1有14个，stx2有2个，eae有4个，hly有13个；育肥场二25株STEC中毒力基因stx1+stx2有7个，stx1有18个，hly有16个；繁育场24株STEC中毒力基因stx1+stx2有11个，stx1有13个，hly有22个。整体上，毒力基因eae的检出数量较少，hly的检出数量较多。育肥场一和育肥场二以stx1为主，检出率分别为70.0%和72.0%，但是繁育场中以stx1+stx2和stx1为主，检出率分别为46.2%和53.8%。

表2 羊源STEC及毒力基因的检测结果Table 2 Detection results of sheep source STEC and virulence genes

2.3 养殖场中STEC耐药性的检测结果

对72株非O157 STEC进行药敏纸片检测，结果见图1，整体上药物敏感为中介的菌株数量较少，大部分菌株是敏感，但有一些菌株存在耐药性。主要的耐药抗生素有麦迪霉素(55株，76.4%)、氨苄西林(16株，22.2%)、链霉素(16株，22.2%)、头孢呋辛(12株，16.7%)、头孢西叮(19株，26.4%)、头孢噻吩(34株，47.2%)、头孢唑啉(16株，22.2%)。

图2显示了非O157 STEC菌株多重耐药情况，最多存在耐9种药的菌株(3%)，不耐药的菌株只有8%，大部分菌株都具有耐药性，耐1种和耐2种的分别有24%和22%，其次耐3种、耐4种、耐5种的分别有14%、11%、10%。

3 讨论

3.1 羊肉产业链中养殖场是STEC污染的源头

羊肉污染可以发生在羊养殖、屠宰和销售的各个环节，通过对整个食品生产过程进行全程控制来减少食源性疾病的发生。目前，逐渐形成了实行从农场到餐桌的食品卫生质量监控体系[13]。本研究首先检测了屠宰场和市场中肉样和胴体拭子、加工用具拭子样品中STEC及其毒力基因的污染情况，发现屠宰场胴体拭子中存在STEC，而肉样没有STEC，分析胴体表面因屠宰加工产生了污染；销售市场中的肉样存在STEC，说明销售的其他环节还存在污染。付竹霓[14]研究食源性疾病微生物的三模块调查分析影响食源性疾病暴发的主要危险因素有食品原料污染、食品加工方式、食品加工设备、食品采集季节、操作人员体内携带病菌等。通过调查3个羊养殖场的肛拭子发现存在较多的STEC，检出率达到了37.3%。前期研究报道中，新疆伊犁地区肉牛粪便中STEC的污染达到23.5%[15]。我国也报道了从猪的样品中分离出大量的STEC，污染达到25.42%[16]，相比较本研究羊粪中STEC的污染率更高。3个养殖场中繁育场的分离率最高，在以后的STEC检测中需加强对后备母羊的监测。带菌羊可通过粪便排泄污染当地的食物、草场、水源等，增加了病原菌的传播机会和范围，交叉污染和感染是羊肉污染的来源[17]。

3.2 STEC菌株中毒力基因以stx1为主

目前己知的是stx的类型与引起疾病严重程度具有相关性。本研究养殖场中stx基因以stx1为主，stx1+stx2和stx2较少。白向宁等[18]研究也表明，河南和黑龙江的29株非O157 STEC存在stx1阳性高达86.2%，与本研究结果一致。stx1基因阳性的菌株占有非O157 STEC的大多数。分析3个养殖场中stx基因数量时，繁育场的stx1+stx2的数量明显增多，推测stx1+stx2基因在母畜体内比较稳定。在羊产业链中，整体上eae基因检出率偏低，Bai等[19]研究显示，猪、牛、肉品中301份非O157 STEC菌株中eae基因检出率。Wang等[20]研究表明，中国东部猪、牛、鸡、肉和奶样品分离的30株STEC O157中hly检出率为50%；Meng等[16]研究显示，93份猪源STEC中hly检出率为15.1%。本研究中hly基因的检出率要高于上述研究。推测非0157 STEC中以stx1为主，eae不是主要的毒力基因，hly基因等在非O157 STEC致病性方面作用有待验证。许多不携带eae基因或LEE毒力岛的非O157 STEC菌株也可以导致出血性肠炎和溶血性尿毒症等严重疾病，不同黏附相关基因在不同血清型STEC菌株中分布情况不同，其引起的疾病严重程度也有差异[21]。

3.3 STEC存在较低的耐药性，但多重耐药性较为严重

耐药性调查显示，STEC菌株对β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类抗生素存在较高的耐药性。本研究的羊源非O157 STEC菌株主要对麦迪霉素、氨苄西林、链霉素、头孢呋辛、头孢西叮、头孢噻吩、头孢唑啉产生耐药，比郭强强等[22]报道的绵羊源致病性大肠杆菌的耐药情况还低一些。此外，邵纯纯[23]研究显示，山东省不同家禽粪便中分离鉴定的35株STEC存在不同程度的耐药性，总体上，对β-内酰胺类抗生素耐药率呈现较低水平，与本研究结果一致。多重耐药情况与姚晓慧等[9]的研究结果一致，主要以一耐和二耐为主。值得注意的是，多重耐药性在不断增加，β-内酰胺类抗生素中有5种抗生素都存在不同程度的耐药性。