血清生长停滞特异性蛋白6c.834+7G＞A单核苷酸多态性与重度子痫前期风险增加的相关性

刘力 张敬蕊 张含 侯晓琳 李瑶 罗茜茜

石家庄市第四医院1检验科，2 产科（石家庄050000）

子痫前期（pre-eclampsia，PE）是妊娠期特有的疾病[1]，发生在妊娠期20周之后，病情的严重程度可呈持续性进展，主要表现为妊娠期出现高血压并发蛋白尿，病情严重时可致多个脏器损伤，严重威胁母婴健康[2-3]。子痫前期患者出现血压持续升高、蛋白尿、血清肌酐升高、血小板降低、微血管病性溶血、血清转氨酶水平升高、持续头痛或其它大脑或视觉障碍、持续上腹部疼痛等任一不良情况可诊断为重度子痫前期（severe pre-eclampsia，SPE）[4]。

子痫前期一个重要的病理过程包括子宫螺旋动脉重铸障碍，缺血缺氧，释放多种胎盘因子进入母体血液循环，引起血管内皮细胞受损并激活系统性炎症[5]。其中，胎盘高表达生长停滞特异性蛋 白6（growth arrest-specific protein 6，GAS6）[6]。GAS6是三个受体酪氨酸激酶TAM（Tyro-3/Axl/Mer）的配体，在无生长刺激时，抑制细胞凋亡，属维生素K 依赖蛋白家族[7]。研究证实GAS6 广泛存在于多种组织和细胞中，如生殖细胞、神经细胞、淋巴细胞等，也可在人血清或血浆中检测到[8]，GAS6 与血管的稳态、炎症反应、代谢紊乱和免疫调节密切相关[9]。8个GAS6 单核苷酸多态性已被证实[10]，并且发现中风与GAS6内含子8 中c.834+7G ＞A 密切有关[11]。GAS6 c.834＋7G ＞A位点中AA 基因型和等位基因A在脑梗死、脑出血及急性心肌梗死的病例组中的频率显著低于对照组，提示c.834＋7G ＞A位点AA基因型和A等位基因心绞痛、不稳定心绞痛以及急性心肌缺血患者中具有保护效应[12-13]。2015年的一项基于土耳其人的研究证实，c.834+7G/A位点的多态性与子痫前期之间存在关联[14]。而2017年的另外一项研究表明，中国人群c.834+7G/A位点的多态性在子痫前期病例组和对照组间没有明显差别[15]。

然而GAS6内含子c.834+7G/A位点的多态性是否在中国人群的重度子痫前期患者中有不同基因型的分布，国内外无报道。因此本研究选取重度子痫前期患者作为研究对象，将明确GAS6 单核苷酸多态性是否参与重度子痫前期发病机制，可以预警病情发展并为基因水平治疗干预提供思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料本文为病例对照研究，选取2016年到2018年在我院住院的重度子痫前期患者（SPE组）213例，年龄18～40岁；纳入标准：以人民卫生出版社第9 版《妇产科学》对子痫前期的诊断标准为判定依据：孕20周后出现收缩压≥140 mmHg和（或）舒张压≥90 mmHg，伴有尿蛋白≥0.3 g/24 h或随机尿蛋白定性≥（+）。伴有下面任何一种表现即诊断重度子痫前期：（1）收缩压≥160 mmHg和（或）舒张压≥110 mmHg；（2）肝酶异常：血清转氨酶水平升高于2倍正常值以上；（3）肾功能受损：血肌酐浓度高于2倍正常值以上；（4）血小板计数持续性下降，低于100 × 109/L；（5）肺水肿；（6）神经系统异常。排除标准：（1）患者孕前患有高血压、心脏病、甲状腺疾病、肾脏疾病以及糖尿病等内科疾病；（2）双胎；（3）有复发性流产病史。对照组为正常妊娠临产妇女350例。本研究得到我院伦理委员会的批准（20190007）。

1.2 方法

1.2.1 血清提取及普通风险指标检测入组孕晚期孕妇清晨空腹采集静脉血，EDTA 抗凝血和促凝血各4 mL，EDTA 抗凝血用于对孕妇GAS6的c.834+7 G ＞A位点进行基因分型，促凝血待血液凝固后3 500 r/min 离心15 min，所得血清保存在-80℃冰箱待用。全自动生化分析仪Backman AU5800测定谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肌酐（CREA）和尿蛋白。Wofen TOP 700测定D-D二聚体（D-Dimer）。血小板计数（PLT）由Mindray BC6800评估。

1.2.2 DNA提取及GAS6 c.834+7G ＞A基因分型按照QIAamp DNA blood kit（Qiagen，Germany）说明书从外周血淋巴细胞中提取基因组DNA，并保存至-80℃冰箱待用。采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）对GAS6内含子c.834+7G ＞A进行基因分型，过程简述如下：以外周血基因组DNA为模板，扩增引物序列为：5′-TTCCCTCAAGAAAGAGCCCG-3′和5′-TCTCATCCCAAACCTCCACA-3′，经PCR扩增产生大小为481 bp的产物。扩增在MyCycler 热循环仪系统（Bio-Rad，United States）中进行，条件如下：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延长7 min。用限制性内切酶Hha I 消化扩增产物。消化后PCR 产物在3%琼脂糖凝胶上电泳并用溴化乙锭染色，在紫外光下拍摄凝胶图片并记录。根据DNA 片段大小及分布，可对GAS6 c.834+7G ＞A位点进行基因分型。基因分型依据为：有两个条带，大小分别为345 bp和136 bp，其基因型为AA型；有3个条带，大小分别为481 bp、345 bp和136 bp，其基因型为AG型；仅有一个条带，大小为481 bp，其基因型为GG。

1.3 统计学方法计量资料均以均数±标准差表示。应用Levene检验对数据进行正态性分布及方差齐性检验。配对t检验和方差分析用于比较病例组和对照组之间计量资料的差异。检验对照组人群各基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡，以判断所选人群是否存在基因型或等位基因的分布偏差，从而确定其对整体人群的代表性。χ2检验用于决定Hardy-Weiberg 平衡下的基因型分布，对比对照组与患者间等位基因和基因型频数差别。采用非条件Logistic 回归模型计算比值比（OR）及95%置信区间（95%CI）。用SPSS 22.0 统计软件进行数据统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SPE病例对照组普通风险指标差异明显两组间普通风险指标差异见表1。对年龄、孕周等指标做计量资料单因素分析结果显示所有指标呈正态分布且方差齐性，其中SPE病例组生产时的孕周、血小板计数显著低于对照组（P＜0.05），收缩压、舒张压、血肌酐、尿蛋白和D-Dimer 显著高于对照组（P＜0.05）。

表1 病例组和对照组普通风险指标差异Tab.1 Common risk parameters in SPE and control groups±s

表1 病例组和对照组普通风险指标差异Tab.1 Common risk parameters in SPE and control groups±s

注：*P ＜0.05

风险指标年龄（岁）孕周体质量指数（kg/m2 ）收缩压（mmHg）舒张压（mmHg）尿蛋白（g/24 h）PLT（109 /L）CREA（μmol/L）ALT（U/L）AST（U/L）D-Dimer（ng/L）SPE 组（n=213）28.9±4.4 34.1±3.2* 24.3±4.5 161±17* 104±13* 2.9±1.1* 187±63* 99±45.6* 20.4±9.1 23.3±8.7 4.7±1.1* 对照组（n=350）28.2±4.7 37.6±2.3 25.1±3.6 116±13 78±13 0.08±0.03 297±60 57.6±21.3 13.7±5.6 16.2±6.1 2.2±0.9

图1 GAS6 c.834+7G ＞A位点三种基因型频率Fig.1 Genotype frequencies of GAS6 c.834+7G ＞A

2.2 SPE病例对照组各基因型及等位基因分布差异明显PCR 产物经限制性内切酶处理后，GAS6 c.834+7G ＞A位点3 种基因型电泳结果如图1A，按照PCR 产物经酶处理后电泳结果将所有受试者进行基因分型。经过基因分型发现（图1B），GAS6 c.834+7G ＞A的基因型AA、AG和GG在350例对照组人群中则分别是27.4%（96/350）、52.6%（184/350）和20.0%（70/350），在213例SPE 患者中的表达分别是20.6%（44/213）、28.2%（60/213）和51.2%（109/213）。其中基因型AA和AG 从对照组到SPE组有明显下降趋势（图1B）。SPE组等位基因A和G频率分别为34.9%（149/426）和65.1%（277/426）；对照组中分别为53.7%（376/700）和46.3%（324/700）。等位基因A和G进行χ2检验（表2），发现其在SPE 组和对照组之间存在差异（χ2= 37.364，P＜0.05）。将基因型进行χ2检验发现，其在SPE组与对照组间差异有统计学意义（χ2= 61.109，P＜0.05）。由于基因型分为3型，将其进行两两比较发现（表2），基因型AA和AG在SPE 组与对照组间差异无统计学意义（χ2= 2.107，P= 0.147），AA和GG在SPE 组与对照组间差异有统计学意义（χ2=27.327，P＜0.05），AG和GG在PE 组与对照组间差异有统计学意义（χ2= 56.724，P＜0.05），AA和AG+GG在PE 组与对照组间差异无统计学意义（χ2= 3.250，P= 0.071），AG和AA+GG在SPE 组与对照组间有显著意义（χ2=32.110，P＜0.05），GG和AA+AG在SPE 组与对照组间差异有统计学意义（χ2=59.340，P＜0.05）。

2.3 等位基因G和基因型GG可能与重度子痫前期风险增加有关从表3可以看出，SPE 组GAS6 c.834+7G ＞A位点等位基因G 频率（0.651）高于对照组（0.463）（P＜0.05），SPE 组GAS6 c.834+7G ＞A位点基因型GG 频率（0.512）明显高于对照组（0.200）（P＜0.05），提示等位基因G及基因型GG可能为风险因素。

3 讨论

表2 3 种基因型两两比较结果Tab.2 Comparative analysis among three genotypes例

表3 SPE 组和对照组基因型和等位基因频率Tab.3 Genotype and allele frequencies in SPE and control groups例（%）

经χ2检验，健康对照组基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡（P= 0.749）。单因素分析后重点考虑基因型的影响，利用Logistic 线性回归分析结果发现，如果选取AA为比对参考（表3），则AG、GG及AG+GG的OR（95%CI）分别为0.711（0.449～1.128）、3.397（2.131～5.416）和1.452（0.967～2.180）。如果选取AG为比对参考（表3），则AA、GG及AA+GG的OR（95%CI）分别为：1.406（0.887～2.228）、4.775（3.143～7.256）和2.827（1.962～4.071）。等位基因Logistic 分析发现，如果选取A为比对参考，则G的OR（95%CI）为2.157（1.683～2.766）。

统计分析结果表明（表3），SPE 组等位基因G及GG 基因型频率明显高于对照组（GG：0.512vs.0.200；G：0.651vs.0.463），提示等位基因G及基因型GG为风险因素。

为了明确GAS6 c.834+7G ＞A的单核苷酸多态性（SNP）与重度子痫前期（SPE）风险增加的相关性，本研究按照病例对照实验方法对受试者GAS6 c.834+7G ＞A进行了基因分型。结果显示（表3），基因型AA、AG和GG在213名SPE 患者中的频率排布为AA ＜AG ＜GG，基因型GG 占大部分（51.2%，表2），350名对照者三种基因型的频率为GG ＜AA ＜AG，基因型AG 占优势（52.6%）。可以看出，SPE 组基因型等位基因向G 偏移，多为纯合型GG（占51.2%），对照组基因型等位基因向A 偏移，多为杂合型AG（占52.6%），提示等位基因G及基因型GG为风险因素。

越来越多的研究表明GAS6-Axl 系统参与维持内皮细胞稳态、调节细胞存活、增殖、迁移、粘附和吞噬[9，16-17]。临床数据表明子痫前期具有家族倾向性，但遗传方式尚不明确[18]。GAS6 基因存在至少8个单核苷酸多肽位点[10，19]，有学者研究结果发现，2型糖尿病组GAS6 c.834+7G/A位点的A 等位基因频率低于正常对照组[20-21]，而有研究发现，急性冠状动脉综合征患者GAS位点的AA 基因型和A 等位基因检出率低于对照组[12]。又鉴于GAS在血管内皮损伤中发挥着重要作用，所以该位点的单核苷酸多态性可能与子痫前期的临床表现相关[22]。OZAKPINAR 等的研究证实，834+7G/A位点的多态性与子痫前期之间存在关联，基因位点A可能有保护作用[14]。而YE 等[15]的一项研究表明，834+7G/A位点的多态性在子痫前期病例组和对照组间没有明显差别，而是另一个位点834+1332C/T 与PE 风险相关。本实验结果显示，SPE病例组GG 基因型是最常见的，SPE 组GAS6 c.834+7G ＞A位点基因型GG 频率（0.512）明显高于对照组（0.200）（P＜0.05）；且相对于AA 基因型，GG 基因型患病的风险提高约3.4倍（OR= 3.397，95%CI：2.131～5.416），完全落入OZAKPINAR 等[14]的OR95%置信区间（OR= 3.508，95%CI：1.352～9.102）内；基因型AA和AG 频率也明显低于对照组。相比于基因型AG，基因型AA和GG 患病的风险分别提高约1.4倍（OR= 1.406，95%CI：0.887～2.228）和4.8倍（OR= 4.775，95%CI：3.143～7.256），提 示GAS6 c.834+7G/A位点的基因型GG和SPE的风险增加有关，即GG 基因型为风险指标。SPE 组GAS6 c.834+7G ＞A位点等位基因G 频率（0.651）高于对照组（0.463）（P＜0.05），且与等位基因A 比较，等位基因G 患病的风险提高2.2倍（OR= 2.157，95%CI：1.683～2.766），同样落入OZAKPINAR 等[14]的OR95%CI（OR= 2.118，95%CI：1.330～3.371），提示GAS6 c.834+7G/A位点的等位基因G和SPE的风险增加有关，即等位基因G 具有风险指标。进一步分析OZAKPINAR 等[14]的其他数据可以得出相似的结论，因此本实验河北省育龄妇女的研究结果和OZAKPINAR 等的结果一致。综上所述，GAS6 c.834+7G ＞A 等位基因G和基因型GG 与重度子痫前期的风险增加有关。

重度子痫前期临床表现包括患者血压升高，肝脏肾脏功能损害，肺水肿，神经系统异常等，具体实验室指标包括：蛋白尿、血肌酐，血小板计数、转氨酶等[2，23]。本研究也比较了病例对照组中上述风险指标，发现虽然大多数（如孕周、血小板计数、收缩压、舒张压、血肌酐、尿蛋白和D-Dimer 等）差异明显，但其中一些指标即使在病例组也与正常值参考范围有重叠。这个现象提示风险指标预警可能并不绝对，且都是出现重度子痫前期病症后表现出的风险指标预警。而GAS6 c.834+7G ＞A基因型可以在疾病发生之前进行预警，将高危孕妇纳入重点保护范围，为可能的疾病发生提供及早及时的防治策略。

YE等[15]基于四川人群的研究表明，GAS6 c.834+7G ＞A位点的多态性在子痫前期（包括中度及重度）病例组和对照组间没有明显差别。分析YE等[15]对照组发现GAS6 c.834+7G ＞A位点的等位进A 基因频率（0.26）远远低于OZAKPINAR 等[14]统计的正常土耳其人及本研究结果中A 基因频率（0.54），提示人群的遗传异质性可能会影响结果。而本研究基于本地区育龄妇女亦有可能有遗传异质性，期待更大规模纳入中国各个不同地区的回顾性分析解决这一问题。

综上，基于河北省育龄妇女的研究证明GAS6 c.834+7G ＞A的多态性与重度子痫前期风险增加有关，且等位基因G和基因型GG可能是重度子痫前期的风险因素，GAS6 c.834+7G ＞A的多态性基因分型可用于重度子痫前期的预后预断。