钙调蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN62对肝星状细胞增殖、凋亡的影响及机制

王路广 戴琳玉 闫宇 肖永红

1华北理工大学公共卫生学院（河北唐山063210）；2 天津医科大学第二医院（天津300211）

多种因素引发肝脏慢性损伤后产生的代偿性修复反应称为肝纤维化[1]。肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化在肝纤维化的进展中起重要作用，导致胶原生成、沉积形成肝纤维化，进一步发展到肝硬化。因此，延迟活化的HSC的增殖和诱导其凋亡是阻断、抑制或逆转肝纤维化的治疗策略[2]。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是刺激HSC 活化、增殖的促纤维化细胞因子之一，可以促进钙调蛋白激酶Ⅱ（calmodulin kinase Ⅱ，CaMK Ⅱ）mRNA 以及磷酸化的CaMKII表达，增加细胞外基质及胶原蛋白合成[3-4]。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）为各类器官纤维化发病机制中的信号串联转导通路，其介导的凋亡途径是近年来发现的新的凋亡途径[5]。CaMKⅡ是一种功能多样的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过调节从内质网到细胞质的细胞内Ca2+动员，充当ERS和相关细胞凋亡的关键介质，在体内广泛参与细胞生理功能调节，包括细胞钙稳态、细胞形态、凋亡等[6]。近年来研究发现干预CaMKⅡ的激活有效改善了心肌、肺、肾脏以及口腔黏膜等纤维化的发生发展[7-10]，对肝纤维化的进展亦有阻逆作用[11]，然而具体作用机制复杂，是否引发了ERS 凋亡途径从而影响HSC的增殖和激活，目前尚不清楚。故本研究应用CaMKⅡ抑制剂KN62 作用TGF-β1刺激的HSC，探讨其对细胞增殖、凋亡的影响及可能的机制，以寻找防治肝纤维化新的途径。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂LX2 人肝星形细胞（LX2-HSC）（上海美轩生物科技有限公司）；KN62 粉末购自美国Apexbio公司，胎牛血清（FBS）、磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶均购自美国BI公司，DMEM高糖培养基、TGF-β1（批号：PHG 9204）购自美国Gibco公司，青霉素、链霉素混合液（双抗）购自美国Sigma公司，细胞增殖检测试剂盒（CCK-8）、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒均购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，一步TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自大连美仑生物科技有限公司，蛋白酶抑制剂、RIPA 裂解液购自武汉贝博生物公司，BCA蛋白定量试剂盒购自杭州联科生物公司，兔抗CaMKII多克隆抗体、兔抗Bcl-2多克隆抗体、兔抗Bax 单克隆抗体、兔抗caspase-12多克隆抗体购自美国Arigo公司，兔抗β-actin多克隆抗体购自美国ABclonal公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记抗兔IgG（H+L）购自美国KPL公司。

1.2 细胞培养将存放于液氮中的LX2-HSC细胞复苏、传代，于含有各100 U/mL 青霉素、链霉素、10%血清的DMEM 高糖培养基的培养液中培养，置于37℃、5% CO2的细胞孵育箱中培养，隔天换液。当细胞密度达到80%～90%时，胰蛋白酶进行传代并进行常规培养。

1.3 CCK-8 法检测细胞的增殖选取处于对数生长期的LX2细胞，0.25%胰酶消化离心，以1×103个/孔接种于96孔板，每孔100 μL，细胞孵育箱中培养24 h，更换无血清培养液过夜，分别加入1、5、10、20 μmol/L KN62，各培养1、3、6、12、24 h后，每孔加入10 μL CCK8 溶液培养3 h，于450 nm 下测定各孔吸光值（OD），重复测定3次，计算各组细胞的相对增殖率（relative growth rate，RGR）。RGR=药物组OD值/对照组OD值×100%

根据实验结果，后续实验分为5 组：空白对照组、TGF-β1组、低、中、高浓度KN62+ TGF-β1组。空白对照组加入无血清培养基培养24 h，TGF-β1组加入5 ng/mL TGF-β1作用24 h，低、中、高浓度KN62+TGF-β1组分别用1、5、10 μmol/L KN62 作用6 h，再加入5 ng/mL TGF-β1作用细胞24 h，用上述方法检测不同处理组细胞增殖情况。

1.4 TUNEL 法检测细胞凋亡将处于对数生长期的LX2细胞以2.5×105/mL 接种于24孔板中，每孔500 μL，进行不同分组方法处理后，用4%多聚甲醛常温下固定细胞30 min，用PBS 洗涤1次。在样本上滴加适量Proteinase K（20 μg/mL），室温孵育5 min。严格按照TUNEL 凋亡试剂盒的具体要求操作，于荧光显微镜下观察、拍照，计算出各组凋亡阳性的细胞数及凋亡细胞率，红色为已凋亡细胞之细胞核，蓝色则为尚未凋亡细胞之细胞核，然后计算出各组细胞的凋亡率。凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.5 Western Blot 法检测蛋白的表达情况细胞经分组及处理后，预冷的PBS清洗3遍，加入细胞裂解液（蛋白酶抑制剂：RIPA 裂解液=1∶250）200 μL，冰上裂解细胞30 min后提取细胞总蛋白。采用BCA 试剂盒测定蛋白浓度，100℃干式恒温器中加热10 min，置于-20℃备用。配制12% SDSPAGE 凝胶，蛋白上样量统一为20 μg，进行电泳。湿转1 h，封闭完成后，一抗稀释液4℃震荡过夜，TBST 溶液清洗3次，二抗HRP 标记抗兔IgG（H+L）稀释液37℃孵育1 h，TBST 溶液清洗3次。ECL 发光剂A、B 等量混合，每个条带100 μL检测条带，凝胶成像仪观察蛋白的表达。采用Image J软件测定条带灰度值，计算各组目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法采用SPSS 21.0软件进行数据统计学分析，实验数据以表示，多组均数比较用F分析，两两均数比较用LST检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度KN62 作用不同时间LX2-HSC细胞增殖情况作用1 h，各处理组细胞OD值差异无统计学意义（F=1.778，P＞0.05），作用3 h，不同浓度组OD值差异仍无统计学意义（P＞0.05），作用6 h后各时间点，不同浓度KN62 处理组OD值差异均有统计学意义（P＜0.001），但10 μmol/L 与20 μmol/L KN62 组OD值比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；10 μmol/L KN62 作用12、24 h后，细胞OD值与6 h比较，差异均无统计学意义（P＞0.05，图1）。

图1 不同浓度KN62 作用不同时间对人HSC 增殖的影响Fig.1 Effect of different concentration KN62 on the proliferation of human hepatic stellate cells at different time

2.2 不同处理组LX2-HSC细胞增殖情况不同处理组LX2 增殖率比较差异有统计学意义（F=80.070，P＜0.001）。与空白对照组相比，TGF-β1组LX2增殖率明显升高（P＜0.001），不同浓度KN62 处理组与TGF-β1组比较，增殖率降低，且随着KN62浓度增加，增殖率下降（P＜0.05，表1）。

表1 不同处理组人HSC细胞增殖情况Tab.1 The proliferation of hepatic stellate cell in different treatment groups±s

表1 不同处理组人HSC细胞增殖情况Tab.1 The proliferation of hepatic stellate cell in different treatment groups±s

注：与空白对照组比较，*P ＜0.05；与TGF-β1组比较，#P ＜0.05；与KN62 低浓度+TGF-β1组比较，□P ＜0.05；与KN62 中浓度+TGF-β1组比较，△P ＜0.05

组别空白对照组TGF-β1组KN62 低浓度+TGF-β1组KN62 中浓度+TGF-β1组KN62 高浓度+TGF-β1组例数3 3 3 3 3 OD 值0.822±0.053 0.972±0.047* 0.674±0.063*# 0.552±0.038*#□ 0.409±0.035*#□△ RGR（%）100.0 119.0 82.3 67.4 50.1 F 值80.070 P 值＜0.001

2.3 不同处理组LX2-HSC 凋亡情况不同处理组LX2 凋亡率比较差异有统计学意义（F=73.199，P＜0.001）。TGF-β1组与空白对照组比较，LX2细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）；低、中、高浓度KN62 处理组细胞凋亡率较TGF-β1组显著升高（P＜0.05），随KN62 浓度的增加，LX2的细胞凋亡率增高（P＜0.001，图2、表2）。

表2 不同处理组人HSC 凋亡情况Tab.2 The apoptosis changes of human hepatic stellate cell in different treatment groups ±s

表2 不同处理组人HSC 凋亡情况Tab.2 The apoptosis changes of human hepatic stellate cell in different treatment groups ±s

注：与空白对照组比较，*P ＜0.05；与TGF-β1组比较，#P ＜0.05；与KN62 低浓度+TGF-β1组比，□P ＜0.05；与KN62 中浓度+TGF-β1组比较，△P ＜0.05

组别空白对照组TGF-β1组KN62 低浓度+TGF-β1组KN62 中浓度+TGF-β1组KN62 高浓度+TGF-β1组例数3 3 3 3 3凋亡率（%）13.6±2.6 13.5±2.3 30.8±6.1*# 54.5±4.5*#□ 75.7±5.6*#□△ F 值73.199 P 值＜0.001

2.4 不同处理组LX2-HSC内CaMKⅡ蛋白的表达不同处理组细胞中CaMKⅡ的表达差异均有统计学意义（F=84.355，P＜0.001）。与空白对照组比较，TGF-β1组CaMKⅡ蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与TGF-β1组比较，不同浓度KN62 处理组细胞中CaMKⅡ蛋白表达明显减少（P＜0.05），且随浓度增加，CaMKⅡ蛋白表达降低，差异有统计学意义（P＜0.001，图3）。

2.5 不同处理组LX2-HSC内Bcl-2、Bax蛋白的表达不同处理组细胞中Bcl-2及Bax的表达差异均有统计学意义（F=110.896，P＜0.001；F=156.086，P＜0.001）。与空白对照组和TGF-β1组相比，不同浓度KN62 处理组细胞中Bcl-2蛋白表达明显均减少（P＜0.001），Bax蛋白表达均明显增加，且Bcl-2/Bax的比值显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.001，图4）。

2.6 不同处理组LX2-HSC内caspase-12蛋白的表达不同处理组细胞中procaspase-12和cleaved caspase-12的表达差异均有统计学意义（F=115.654，P＜0.001；F=217.927，P＜0.001）。不同浓度KN62 处理组与TGF-β1组比较，procaspase-12和cleaved caspase-12蛋白表达增高（P＜0.001），且随KN62 浓度的增加，LX2的细胞中procaspase-12和cleaved caspase-12蛋白表达升高（P＜0.001，图5）。

3 讨论

图2 不同处理组人HSC 凋亡情况Fig.2 The apoptosis changes of human hepatic stellate cell in different treatment groups

目前认为，TGF-β1为肝脏中最强的促纤维化因子[12]。研究[13]表明，抑制TGF-β1及阻止CaMKⅡ的激活后消除了TGF-β刺激的胶原蛋白、纤连蛋白和α平滑肌肌动蛋白的表达。CaMKⅡ的表达及其活性在介导ERS凋亡途径中发挥重要调节作用，且参与多种器官纤维化的发生发展[14-15]。BIAN 等[16]发现，由四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型中，ERS 调控细胞凋亡时，通过ERS 相关蛋白及肝纤维化因子表达等影响肝纤维化的发展进程。为此，本研究应用CaMKⅡ抑制剂KN62 作用于TGF-β1刺激的LX2，探讨CaMKⅡ在肝纤维化发生发展过程中能否介导ERS 凋亡途径进而影响HSC 增殖及凋亡过程。

ZHAO 等[17]发现，CaMKⅡ在人脐静脉内皮细胞中具有重要的生理调节功能，抑制其活性后，显著降低了内皮细胞增殖。LUO 等[18]报道，在CaMKⅡ抑制剂KN62的作用下减弱了去甲肾上腺素诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖。本研究显示，1、5、10 μmol/L KN62均能抑制细胞增殖，随KN62浓度的增加增殖率降低。表明KN62能够抑制TGF-β1刺激的LX2细胞增殖，提示CaMK II参与HSC的增殖调控过程，其特异性抑制剂KN62可以阻抑LX2细胞增殖。

Bcl-2是重要的抑制凋亡蛋白，Bax是促进细胞凋亡的重要分子，Bcl-2和Bax 两种凋亡调控蛋

图3 不同处理组人HSC 中CaMKII蛋白的表达Fig.3 The expressions of CaMKII in human hepatic stellate cell different groups

图4 不同处理组人HSC 中Bcl-2、Bax蛋白的表达Fig.4 The expressions of Bcl-2 and Bax in human hepatic stellate cell different groups

图5 不同处理组人HSC 中caspase-12蛋白的表达Fig.5 The expressions of caspase-12 in human hepatic stellate cell different groups

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与TGF-β1组比较，#P＜0.05；与KN62 低浓度+TGF-β1组比较，□P＜0.05；与KN62 中浓度+TGF-β1组比较，△P＜0.05白保持平衡状态，是诱导细胞凋亡的关键[19]。有报道[20-21]，HSC 中Bcl-2和Bax在肝纤维化和慢性肝病的发展进程中都发挥了重要作用，但具体作用机制尚不明确。而MIN 等[22]发现，通过抑制CaMKⅡ的磷酸化来抑制新生儿缺氧缺血性神经元损伤中的促凋亡信号通路，可增加Bcl-2/Bax蛋白比值。本研究结果显示，不同KN62药物浓度处理组CaMKⅡ的表达明显低于空白对照组和TGF-β1组，Bax蛋白表达均显著升高，Bcl-2蛋白表达则明显降低，且随药物浓度增加Bcl-2/Bax的比值随之减少，提示诱导细胞进入凋亡程序。从本研究细胞凋亡实验也可看出不同KN62 药物浓度处理组均明显促进了LX2细胞凋亡，且随KN62 浓度的增加，LX2的细胞凋亡率增高，说明抑制CaMKⅡ表达后可以促进TGF-β1刺激的LX2细胞的凋亡，进而延缓肝纤维化的发展。

本课题组之前通过体外实验已证实ERS可以促进HSC细胞凋亡，改善肝纤维化的发展进程[23]。Caspase-12是caspase 家族中仅在ERS 通路中被活化的促凋亡蛋白，ERS 诱导细胞凋亡时，caspase-12表达上调，激活促细胞凋亡信号通路，启动凋亡反应[24]。Caspase-12 本身以无活性的酶原形式procaspase-12存在，激活后转变为有活性的cleaved caspase-12。ERS 早期通过诱导未折叠蛋白应答恢复细胞稳态起保护作用，procaspase-12蛋白表达增加；随着ERS 时间延长，cleaved caspase-12蛋白表达增加，从而诱导细胞走向凋亡。本研究中，随着CaMKⅡ抑制剂KN62 浓度的增加，procaspase-12及cleaved caspase-12蛋白表达增加，且明显高于空白对照组和TGF-β1组，表明KN62 增加了促凋亡蛋白caspase-12的表达。

本研究发现CaMKⅡ抑制剂KN62 能够抑制LX2 增殖并诱导其凋亡，可能与caspase-12 依赖性ERS 途径有关，提示抑制CaMKⅡ其表达可能参与介导ERS 而使HSC 进入凋亡程序，以有效改善肝纤维化，可为临床肝纤维化治疗提供新的作用靶点。但本实验仅探讨了CaMKⅡ在抗纤维化的可能作用机制，有关抑制CaMKⅡ介导ERS 何种途径促进HSC 凋亡，以及CaMKⅡ抑制剂对ERS 凋亡途径的确切作用机制接下来将做进一步研究。