宏基因组测序在感染性疾病诊治中的应用进展

朱美利 张剑青 赵芝焕

昆明医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学二科（昆明650032）

感染性疾病是由细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原体及其产物导致人体局部或全身性炎症，临床表现多样，病情复杂，病死率较高，及时明确病因，采取针对性治疗措施，能较好控制疾病的进展。传统病原学检测方法，由于操作复杂，耗时长，检测效率低等特点，不能满足感染性疾病及时诊治的需要。临床上急需一种高效、准确、全面的病原体检测方法，指导感染性疾病及时诊断及治疗。

高通量测序技术，又称下一代测序技术，是相对于Sanger测序法为代表的传统测序技术而言的新型测序手段[1]。高通量测序采用的是并行测序技术，单次运行可以完成上百万甚至千万次测序实验，产出的序列数据量大，运用该技术能够一次性检测获得样品中可能感染的多种病原体基因组序列，对混合侵入性感染样品中多种病原菌检测鉴定具有很好的应用[2]。

宏基因组测序是高通量测序在微生物研究中的一个重要应用，是对环境样品中的微生物遗传物质进行高通量测序，该方法能够快速、准确、高效获得整个微生物群的基因组信息，不依赖于微生物的分离培养，直接从环境中提取微生物的遗传物质，通过基因分析鉴定微生物类型。本文主要介绍宏基因组测序在感染性疾病病原菌鉴定中的应用，旨在为临床医生在感染性疾病的诊治中提供一个更实用、可靠的检测手段。

1 感染性疾病的诊治现状

感染性疾病是造成全球患者发病及死亡的主要原因，造成较重的疾病负担[3]。病原体的早期识别和准确诊断对及时、特异、有效的治疗感染性疾病至关重要[4]。由于抗生素、激素、免疫抑制剂的大量使用，恶性肿瘤、免疫缺陷患者增多，临床病原体呈现复杂化、多样化的趋势，致病菌难以准确鉴定，感染性疾病诊治困难。传统微生物检测方法很多，其中标本培养是病原体诊断的金标准，需预估病原体类型，提供适宜的培养条件，耗时长、操作复杂，易受临床抗生素的使用、机体免疫状态的影响，检出率低[5]；血清学法目前研发的抗原、抗体数量有限，难以满足多样化病原体检测需求；PCR 法需预估可能的病原体，无法完成高通量检测，检测效率低；基因芯片只能对已知病原体进行筛查，无法检测新的病原体。传统病原体检测法的局限性阻碍了感染性疾病病原体的快速检测和鉴定，延误理想的治疗时间。各种新发和再发的感染性疾病、不易发现的多重感染以及不明病因的发热等，都给人类健康带来了巨大的威胁，临床上对感染性疾病诊断的准确性和时效性提出了更高的要求。宏基因组测序以其快速、高效、准确的微生物检测优点运用于感染性疾病的诊治[6]。

2 宏基因组测序在感染性疾病诊治中的应用

随着环境的变化，全球人口老龄化加剧，感染性疾病患病率及病死率增加。传统病原体检测方法难以满足临床感染性疾病高效诊治的需求。随着高通量测序技术的快速发展和测序成本的大幅降低，宏基因组测序已成为一种有希望用于感染性疾病准确诊断的通用病原体检测方法[7]。宏基因组测序可以对任何类型的病原体进行鉴定，甚至可以用于识别新的病原体，这可能会替代许多目标病原体检测[8]，现从以下四个方面介绍宏基因组测序指导临床感染性疾病的诊治。

2.1 宏基因组测序在呼吸系统感染中的应用呼吸系统感染是临床常见病、多发病，是造成婴幼儿、儿童、老人及免疫低下患者发病及致死的重要因素。有研究[9-10]显示，在成人社区获得性肺炎中，由于病原菌培养的灵敏度低、时间要求长，血清学和PCR 试验检测的微生物数量有限等原因，仅有38%的病原菌能够被检测出来。已有报道宏基因组测序运用于呼吸系统感染诊治中，ZOU 等[11]利用宏基因组测序在不明原因肺炎患者中检测出麻疹病毒，表明宏基因组测序在挑剔病原菌鉴定中具有一定优势。LI 等[12]对20例可疑肺部感染患者的肺组织标本进行检测，结果显示，宏基因组测序与培养法相比，细菌鉴定的敏感性和特异性分别为100%、76.5%，阴性预测值为100%，该研究中宏基因组测序比其他检测法能鉴定出更多的病原菌，涵盖难以检测的厌氧菌和挑剔菌，具有潜在的速度及敏感性优势。XIE 等[13]对ICU 病房重症肺炎患者进行研究，130例行常规临床检测为对照组，48例行宏基因组测序为观察组，两组根据检测结果调整抗生素方案，结果显示，观察组28 d 病死率明显低于对照组（16.7%vs.37.7%），90 d 病死率也明显低于对照组（16.7%vs.42.3%），宏基因组测序检出致病菌阳性率明显高于对照组（68.7%vs.45.4%），表明宏基因组测序比常规检测能够更快速、准确地检测病原体，及时调整抗生素，显著降低重症肺炎的病死率。宏基因组测序在呼吸道感染性疾病病原体检测中具有较高的检测效率，能快速、准确检测病原菌，提高呼吸系统感染性疾病的精准诊治能力。

2.2 宏基因组测序在中枢神经系统感染中的应用全球中枢神经系统感染具有较高的发病率及病死率，造成严重的国际负担，全球对中枢神经系统感染的高质量诊治能力具有较大的需求[14]。由于传统病原学检测方法的局限性，半数以上的中枢神经系统感染病例不能明确诊断[15-17]。宏基因组测序法克服传统检测法的局限性，在中枢神经系统感染性疾病诊断中地位越来越高。BROWN等[18]对44例运用宏基因组测序确诊脑炎的患者病例进行回顾性分析后，认为宏基因组测序应被视为慢性和复发性脑炎的一线诊断实验。中枢神经系统感染由多种微生物引起，已确定有100多种不同的病原体可导致中枢神经系统的感染[19]。病毒是引起中枢神经系统感染的主要原因[20]，延误及时有效的治疗将导致病毒性脑炎更高的病死率和严重的神经后遗症[21-22]。已有较多研究报道宏基因组测序成功鉴定出导致中枢神经系统感染的病毒类型[23-24]。MAI 等[25]利用宏基因组测序在1例可疑中枢神经系统感染患者尿液中检测出日本脑炎病毒，经PCR和血清学证实该结果，这是第一次在人体内发现该病毒的存在。中枢神经系统细菌感染也较常见，GUO 等[26]研究中脑脊液宏基因组测序与临床检测法相比，细菌检测敏感性从55.6%提高到68.7%，表明宏基因组测序能提高细菌性脑膜炎患者病原菌检测的总体阳性率。FAN等[27]对4例可疑中枢神经系统感染患者的脑脊液进行宏基因组测序，48 h内均检出布鲁氏菌，利用PCR和Sanger测序对上述结果进行验证，而培养法仅有其中1例患者脑脊液培养7 d后发现布鲁氏菌为阳性，表明宏基因组测序检测病原菌比培养法更迅速、高效、准确。YAO 等[28]报道了3例脑脊液培养阴性，经脑脊液宏基因组测序确诊单核细胞增多性李斯特菌感染病例，第一次成功将宏基因组测序技术运用于单核细胞增多性李斯特菌感染的确诊。真菌导致中枢神经系统的感染并不少见，尤其在免疫缺陷患者中，真菌感染是毁灭性的，病死率高，存活个体遗留持久的神经后遗症[29-32]。WILSON 等[33]对7例脑膜炎患者的脑脊液行宏基因组测序，4例患者中检测出真菌感染，病例1为免疫缺陷患者，检出新型隐球菌，血清学检测验证该结果；病例2为可疑神经系统感染的患者，覆盖细菌、真菌、疱疹病毒、结核的治疗，效果不佳，宏基因组测序脑脊液发现组织胞浆菌荚膜，与真菌培养及PCR 结果一致；病例3是诊断困难患者，常规临床检测阴性，脑脊液宏基因组测序发现米曲霉菌，脑脊液PCR检测验证该结果；病例4 临床常规微生物检测阴性，甚至脑组织活检未能明确诊断，脑脊液宏基因组测序发现杜氏假丝酵母菌。该研究表明宏基因组测序在中枢神经系统真菌感染诊断方面比传统检测法更敏感、准确，在真菌感染诊治中具有较高的运用价值。已有文献报道宏基因组测序运用于中枢神经系统寄生虫感染鉴定[34-36]。LIU 等[37]报道1例诊断困难的可疑中枢神经系统感染的病例，脑脊液宏基因组测序发现猪带绦虫DNA，确诊脑囊虫病，抗寄生虫治疗后，病情缓解，复查脑脊液猪带绦虫DNA 量大幅下降，该研究第一次将宏基因组测序技术运用于脑囊虫病的诊断，结合病情转归进一步验证检测结果。

宏基因组测序作为一种快速、低成本和高通量的病原体DNA测序技术，已用于中枢神经系统各类病原体感染检测，对比传统病原体检测法，具有较高检测效率及准确性，指导临床治疗，提高中枢神经系统感染的快速诊治水平。

2.3 宏基因组测序在血液系统感染中应用血液感染是临床上重症感染性疾病之一，易诱发脓毒血症，导致较高的发病率及病死率[38-39]，早期快速识别致病微生物、及时抗生素治疗，能降低病死率，减少住院时间、相关费用和抗生素使用[4，40-42]。由于培养法及分子检测技术的局限性，血流感染病原体诊断困难。宏基因组测序运用于血液感染病原体识别已有报道[43-44]。GRUMAZ 等[45]对48例脓毒血症的研究显示，脓毒血症发病时：血培养、宏基因组测序病原菌检测阳性率分别为33%、72%，从整个研究期间来看，病原菌阳性率分别为11%、71%，该研究表明宏基因组测序在血液感染病原体检测中具有更高检测效率。同样的LONG 等[46]对78例可疑脓毒血症患者的血浆行宏基因组测序及培养，结果显示，血培养病原菌检出率为12.82%，宏基因组测序检出率为30.77%，将两种方法检测结果分别与Sanger测序法相比，病原菌检测一致性为81.82%、100%，宏基因组测序法还检出15 种病毒，该研究表明宏基因组测序在血液感染病原体检测中具有较高的敏感性、准确性及全面检测的能力。宏基因组测序作为一种综合性、定量、敏感性高的检测方法，在运行过程中能鉴定出耐药基因，是重症感染、特殊感染、难以明确诊断的血流感染的理想诊断工具。

2.4 宏基因组测序的其他部位感染中的应用宏基因组测序除了在前述系统中运用较多，在其他部位感染性疾病中的运用也有报道。RUPPE 等[47]对24例骨关节感染患者的样本行培养、宏基因组测序，结果显示，8例培养为单菌标本中，宏基因组测序病原菌检出率为100%，抗菌药物敏感性预测为94.1%。16例多微生物样本中，物种水平上，宏基因组测序的灵敏度为58.2%；属水平上，灵敏度提高到74.5%。宏基因组测序检测出培养法未发现的273 种细菌。该研究表明宏基因组测序在骨关节感染病原菌检测中具有较好的运用优势，能在物种水平上鉴定细菌，能同时检测出多种细菌，检测敏感性及效率较高，能为治疗骨关节感染定制抗生素方案。DOAN 等[48]对6例患者眼内标本进行宏基因组测序发现，3例分别检测出单纯疱疹病毒1型、新生隐球菌、弓形虫，该结果被免疫法证实，通过针对病原体的治疗，病情均改善；病例4和5 样本未发现病原菌，与临床实际相符合；病例6为16年双眼慢性葡萄膜炎，PCR 技术病毒检测阴性，眼内液宏基因组测序发现风疹病毒，该结果被Sanger测序证实。该研究表明宏基因组测序可以利用较少的眼内液鉴定葡萄膜炎感染病原体，以其独特的检测优势成功运用于眼内感染病原体检测，为眼睛感染诊治提供一种新的检测工具。

宏基因组测序已在多个系统感染性疾病病原体检测中成功运用，可同时检测感染样本中的细菌、真菌、病毒、寄生虫等多种病原菌，可高效、准确、全面识别病原菌，提高临床对感染性疾病的早期诊断及治疗水平，改善临床预后。

3 宏基因组测序在感染性疾病病原体检测中存在的不足与展望

宏基因组测序技术越来越受到广泛的关注，多篇文献报道了其在感染性疾病病原体检测中成功运用，但其运用仍存在一些不足：（1）来自人类宿主细胞，正常微生物菌群和其他来源的富含核酸的样本存在核酸污染，影响检测结果，限制病原体检测的总体敏感性；（2）临床样本中多样性微生物的存在，使得结果解释更加复杂，目前缺乏统一病原体相对丰度、序列读数的界值，难以准确区分感染、定植及污染；（3）参考数据库不够完整，甚至包含错误信息，可能导致假阳性结果，甚至导致检测结果无法分析；（4）测序成本仍较高，检测费用比许多其他临床试验高，限制其广泛运用；（5）测序生成的大量数据在存储和分析方面存在挑战，需要大量技术及专业知识支持；（6）测序结果复杂多样，缺乏统一的结果分析标准和对报告解释的通用指南。所以，宏基因组测序尚不能取代传统的诊断方法，但可以作为一种补充测试，在常规检测法无法揭示诊断、重症感染或免疫功能严重受损的患者，可作为最后的手段来尝试识别感染过程。

宏基因组测序弥补传统病原体检测法的局限性，以无偏移采样，识别已知的和罕见的病原体，甚至发现新的病原体，允许对这些病原体进行物种级别的鉴定，通过测序读数的计数，提供各种病原菌浓度的定量或半定量数据，有利于在多微生物样品中精确鉴定病原菌，对各个系统感染鉴定均有较好的运用价值，在以后的研究中，需进一步确定标准、规范的操作流程，制定结果分析指南，通过技术升级及改进降低检测成本，完善参考数据库信息，期待宏基因组测序技术在感染性疾病诊治中更深入、广泛的使用，在耐药基因及药敏检测中有所突破，进一步提高感染性疾病的精准诊治能力。