纳米颗粒联合声动力疗法的研究进展

李金林 刘小慧 周畅 刘朝奇 赵云

1三峡大学医学院（湖北宜昌443002）；2 三峡大学第一临床医学院超声科（湖北宜昌443002）

声动力疗法（sonodynamic therapy，SDT）是在光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）基础上发展而来，由YUMITA 等[1]于1989年提出，单独超声波对肿瘤组织具有一定的杀伤力，口服或者静脉注射声敏剂后，联合使用一定频率的超声辐照，杀伤效力明显增强，能够诱导显著地细胞损伤。声敏剂是SDT的关键环节，分为卟啉类及其衍生物、氧杂蒽类、化疗药物类、吩噻嗪类化合物等[2]，由于大部分卟啉类声敏剂的水溶性差，且容易被机体代谢，只有小部分到达肿瘤组织，无法产生有效的治疗活性，这极大地制约了SDT的应用。纳米颗粒（nanoparticles，NPs）是利用纳米技术制备的纳米级微粒或微囊，具有靶向性好、载药量高及体内留存时间长等优点，是声敏剂的良好载体[3]。且纳米颗粒能改善声敏剂的疏水性，优化SDT的靶向治疗、药物转运、多模态成像及早期诊断，将纳米颗粒用于声动力疗法能发挥协同作用显著增强其抗肿瘤效应，并有望用于临床。

1 纳米颗粒增强声动力抗肿瘤效应的可能机制

1.1 活性氧机制SDT 治疗肿瘤的机制研究中，最广泛的学说是活性氧（ROS）机制，ROS 产生后可通过氧化细胞内特异性化学簇，导致激活炎症因子或者DNA 突变，最终导致细胞凋亡[4]。纳米颗粒可以促进ROS的生成来增强SDT 治疗效果。ZHANG 等[5]通过热解和相转移制备聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修饰的负载二氢卟吩（Chlorin e6，Ce6）的顺磁性氧化铁纳米颗粒（paramagnetic iron oxide nanoparticles@Ce6，PION@Ce6），ROS 敏感性荧光指示剂DCFH-DA 用于测定细胞内ROS 产生，在小鼠肝癌模型中观察SDT的治疗效果，结果表明PION@Ce6在水溶液中很好地分散和溶解，而且长时间没有明显的沉淀，与游离Ce6+超声（ultrasound，US）组相比PION@Ce6+US 组表现出更高水平的ROS 产生且肿瘤细胞凋亡率最高。因此，纳米颗粒用于SDT 使声敏剂具有良好的水溶性和稳定性，通过增加ROS的产生增效SDT的抗肿瘤效应。

1.2 降低空化阈值SDT的作用机制中，超声的空化效应也是研究的热点[6]。在超声波作用下液体振动而产生数以万计的微小气泡，即微气泡空化核，这些微气泡在超声波传播形成的正负压强下压缩和拉伸，在气泡被压缩直至崩溃的瞬间，产生巨大的瞬时压力和高温，释放出大量的能量杀伤肿瘤细胞，即超声空化效应[7]。超声波的高空化阈值，导致治疗持续时间长和超声强度高，是SDT 亟待解决的问题[8]。研究[9]发现，二氧化钛纳米颗粒（titanium dioxide nanoparticles，TiO2NPs）可以被作为空化促进剂，丰富空化成核位点降低空化阈值来增强超声空化效应。MIYOSHI 等[10]制备了TiO2NPs，分为US 组和US＋TiO2NPs 组，使用光谱分析仪检测空化信号，证实US＋TiO2NPs 组空化信号较US 组增加了28%，加速了靶组织的坏死，缩短了治疗时间，避免损伤周围正常组织，因此纳米颗粒用于SDT 使空化效应显著增强，治疗更具安全性和有效性。

1.3 抑制肿瘤血管生成新生血管的形成是肿瘤生长和侵袭的重要因素，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可在体内诱导血管新生，有效的促进血管及淋巴管的再生。SDT能够通过多种机制破坏血管屏障，增加药物转运并明显减少肿瘤组织血液供应，并抑制血管内皮生长因子表达，从而抑制血管内皮细胞增殖、迁移，进而抑制血管管腔的形成[11]。联合纳米颗粒可以增效抑制作用。CHEN 等[12]构建了载有紫杉醇PTX/吲哚青绿ICG的PLGA NPs，在卵巢癌细胞SKOV3 模型中观察SDT 疗效，通过积分光密度（IOD）定量分析VEGF的表达，结果显示，纳米颗粒组VEGF的IOD为各组中最低的，VEGF表达明显受到抑制。VEGF的低表达表明纳米颗粒联合SDT 处理可有效抑制肿瘤血管生成，阻止肿瘤的继续生长介导癌细胞凋亡。

1.4 协同效应利用磁性材料制备的超顺磁纳米颗粒在纳米医学中得到了广泛关注[13]。磁性纳米颗粒可以对外加磁场做出响应，产生热量，提高靶区温度而产生热效应[14]。ZHOU 等[15]设计了超顺磁氧化铁纳米颗粒（superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs），用全氟羟基己烷（PFH）填充后，体内实验显示，暴露于外部磁场后，肿瘤生长部位的温度快速上升，产生热效应加速了靶组织的凋亡和坏死，表现出高效的磁热疗作用。说明纳米颗粒促进SDT 与热疗协同，对治疗肿瘤提供了新的方法与思路。

2 不同纳米颗粒在SDT 中的应用展望

2.1 脂质体纳米颗粒在SDT 中的应用脂质体通常被用作主要的纳米颗粒制备材料[16]。研究[17]表明，脂质体纳米颗粒具有优异的生物相容性、可降解性和稳定性，而被广泛使用。脂质体是由脂质双分子层形成的球形囊泡，由于其独特的结构，利用脂质双层将疏水性药物捕获在内层，保护药物免于降解。脂质体的高稳定性及在脂膜保护下药物可以被高效运输到组织或靶器官。YUE 等[18]使用脂质体作为纳米载体，通过逆相蒸发法共同包封两种疏水性分子，血卟啉单甲醚（HMME，良好的光/声敏剂）和免疫激动剂咪喹莫特（R837），获得的HMME-R837@Lip NPs 复合纳米颗粒在水溶液中均匀分散，为粒径均一的球体，动态光散射（DLS）测得纳米颗粒动力学直径为约157.3 nm，纳米级尺寸有利于通过渗透增强效应（EPR）进入到肿瘤中，体外研究发现将100 μg/mL HMME-R837@Lip NPs 与小鼠乳腺癌细胞株（4T1）37℃共同孵育4 h，使用超声辐照1 min（频率1.0 MHz，强度1.5 W/cm2），细胞损伤率高达90%，但相同条件下单独超声辐照或HMME-R837@Lip NPs 给药并未发现明显的细胞损伤，说明HMME-R837 NPs 联合SDT 具有协同治疗效果。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）下发现大多数HMME-R837@Lip NPs在4 h内被4T1细胞迅速内化，且没有明显的外排（＜3%），这种有效的细胞内摄取和低排出显示出纳米颗粒在癌细胞内的高聚集性，为增效SDT的治疗效果提供了前提。随后，YUE 等[18]进一步研究了HMME-R837@Lip NPs和SDT 联合治疗后对免疫系统的改变，二者联合可以增强肿瘤免疫治疗，激活机体抗肿瘤免疫应答，从而杀伤肿瘤细胞。在肿瘤微环境中，免疫细胞对肿瘤的起始、发展和生长起关键作用，树突状细胞（DC）是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过检测共刺激分子CD80/CD86（树突状细胞成熟的代表性标志物）的上调来评价HMMER837@Lip NPs的免疫效应。该团队给小鼠右胸皮下接种4T1细胞6 d后，采用尾静脉给药方式注射HMME-R837@Lip NPs，12 h后超声辐照5 min（频率1.0 MHz，强度1.5 W/cm2），治疗3 d后发现单独HMME-R837@Lip NPs 或超声只有微量的DC细胞成熟，而在HMME-R837@Lip NPs 联合超声组DC成熟度达到28%，提示HMME-R837@Lip NPs 联合SDT 能显著促进DC 成熟，通过激活自身免疫反应，增强对肿瘤组织的杀伤力。

2.2 二氧化硅纳米颗粒在SDT 中的应用随着纳米技术的发展和对纳米材料的不断研究，发现有些纳米材料具有独特的光/声特性，如Silicon NPs、TiO2NPs[19]、Fe3O4NPs[20]等，能在超声波辐照下释放大量活性氧类物质，产生声动力治疗，开创了无声敏剂型声动力疗法。WANG 等[21]利用介孔二氧化硅纳米颗粒（mesoporous silica nanoparticles，MSN）包裹化疗药物紫杉醇（PTX），将叶酸（FA）及β-环糊精（β-CD）封装在纳米颗粒的表面，制得PTX@FA-β-CD/H-MSN 双效纳米颗粒（double effect silica nanoparticles，DESN），使用非荧光的对苯二甲酸检测羟自由基（OH-）的产生量，发现暴露于超声2 min 时，含有DESN的PBS 溶液的荧光强度比不含有二氧化硅纳米颗粒的PBS 溶液的荧光强度高约4倍，提示DESN 经超声辐照后产生大量活性氧羟自由基（OH-），从而发挥声动力治疗，在体外研究中将小鼠乳腺癌细胞（4T1）与DESN 共同孵育，发现在不同DESN 浓度（0、5、10、20、40 μg/mL）下没有明显的癌细胞损伤，同样的在单独的不同超声强度辐照处理下（0、0.4、0.6、0.8、1.0 W/cm2）细胞存活率也没有差异。但是当DESN（40 μg/mL）联合超声（0.8 W/cm2）处理时4T1细胞存活率降低至16%。说明在没有声敏剂的条件下，具有光/声特性的纳米颗粒联合SDT可以产生明显的细胞损伤，这无疑推动了声动力治疗的发展且对今后的声动力治疗模式提供了新的方向。

2.3 聚合物纳米颗粒在SDT 中的应用聚合物纳米颗粒（polymer nanoparticles，PNP）由于其超小尺寸，多功能性和靶向性，已经越来越多地用于各种生物医学应用。WANG 等[22]以聚乳酸-羟基乙酸共聚物[Poly（lactic-co-glycolic），PLGA]为材料，制备携载青蒿素（ART）和5-氨基乙酰丙酸（ALA）的多功能纳米颗粒HA-PLGA@ART/ALA NPs，将其与肝癌细胞（HepG2）共同孵育4 h，然后进行超声（强度2 W/cm2）处理60 s后，发现单独HA-PLGA@ART/ALA NPS 组和HA-PLGA@ART/ALA NPS+US 组的凋亡率分别为（23.1 ± 0.8）%、（39.5 ± 0.7）%，联合治疗可以显著增强疗效。聚合物纳米颗粒的主要缺点是药物突释，在体内药物突然大量释放易引起副反应[23]。为提供安全的传递系统，壳聚糖（CS）修饰的纳米颗粒成为研究热点。CS（一种天然阳离子多糖）具有高相容性，低免疫原性和低毒性，其多价正电荷使CS 有粘附性，能实现基因、药物的靶向递送[24]。LU 等[25]制备了经CS 修饰的PLGA NPs（CS-PLGA NPs），观察紫杉醇PTX的释放，结果显示：PLGA NPs的药物包封率（EE）值为65.8%，经修饰后的CS-PLGA NPs的EE值提高至87.1%，2 h后PLGA NPs的PTX 释放率为66.9%，呈爆发性释放，而CS-PLGA NPs的PTX 释放率仅为41.9%，且随着CS 含量增加，药物初始释放速度更加缓慢温和。CS对于提高给药安全性、降低不良反应、增加药物包封率都有积极作用。

除了脂质体和聚合物纳米颗粒之外，金属纳米颗粒、磁性纳米颗粒也是携带声敏剂的有效载体。CHOI 等[26]利用具有磁性的四氧化三铁（Fe3O4）制备磁性纳米颗粒，在电镜下看到颗粒呈圆形、大小均一、分布均匀，与叶酸FA和二氢卟吩Ce6 共价连接后，表现出强磁化性、靶向性和优异的相容性。随着颗粒尺寸变小，表面积与体积比变大，包封的药物更接近颗粒表面，从而促进更快的药物释放。

3 纳米颗粒增效声动力的靶向治疗

3.1 纳米颗粒在SDT 主动靶向治疗中的应用近年来，运用靶向纳米颗粒实现主动靶向治疗受到越来越多地关注，使用癌细胞中特定受体的配体（如抗体、蛋白质、多肽、核酸等）功能化纳米颗粒使其具有靶向性，减少化疗毒性并增加肿瘤细胞中的药物积累[27]。经修饰后的纳米颗粒对癌细胞表现出更好的靶向性、低毒性、更高的肿瘤生长抑制效力[28]。靶向纳米颗粒的优势有：（1）改善药物的药代动力学和药效学性质而不改变其分子结构；（2）增强组织靶向（细胞靶向和分子靶向）；（3）逃逸固有生物屏障避免吞噬与降解，达到肿瘤细胞且不损失其有效药物负载；（4）递送具有不同化学性质的多种药物协同治疗[29]。iRGD是一种肿瘤归巢肽，肿瘤识别和高效穿透肿瘤所必需的，特异性结合表达αvβ3和（或）αvβ5蛋白的肿瘤血管和肿瘤细胞。SUN 等[30]制备了经IRGD 修饰且携载声卟啉钠（DVDMS，一种良好声敏剂）的纳米颗粒（iRGD-Lipo-DVDMS NPs），建立小鼠C6 胶质瘤模型，随机分两组分别注射游离DVDMS和iRGDLipo-DVDMS NPs后取肿瘤组织进行荧光检测，显示iRGD-Lipo-DVDMS 组肿瘤的荧光强度是游离DVDMS 组的22.12倍且荧光分布更加均匀，可见iRGD-Lipo-DVDMS NPs 具有积极的肿瘤靶向性能特异地富集在肿瘤区域。在体内实验中，由于测量颅内胶质瘤体积大小存在困难，所以采用中位生存时间和体质量变化来评价疗效，注射药物后5 d内SDT 治疗两次，结果显示小鼠的中位生存时间为iRGD-Lipo-DVDMS NPs（40 d）明显长于生理盐水组（15 d）、游离DVDMS组（19 d），记录小鼠体质量发现对照组和DVDMS-SDT 组的体质量显著下降，iRGD-Lipo-DVDMS NPs-SDT 组轻微下降。存活时间直接反映了iRGD-Lipo-DVDMS NPs 联合SDT在胶质瘤中的高效治疗作用，能有效延长生存时间，改善小鼠的生存状态。表明靶向纳米颗颗粒联合SDT可以显著增强药物肿瘤靶向性，优化治疗效率同时降低副反应，对提高治疗安全性具有重要作用。

3.2 纳米颗粒在SDT 被动靶向治疗中的应用被动靶向首先取决于粒径的大小，被巨噬细胞摄取后自然积集于肝、脾等组织中，从而发挥疗效。纳米颗粒分子粒径小，通过增强渗透和滞留（EPR）效应在肿瘤中自发积累[31]，在被动靶向治疗方面也具有很大潜能。SHEN 等[32]设计了二氧化钛封装Fe3O4的纳米颗粒同时包覆化疗药物阿霉素（Fe3O4@TiO2-DOX NPs），将小鼠分为两组分别注射DOX和Fe3O4@TiO2-DOX NPs后2、6、12、24和48 h后进行体内成像，发现Fe3O4@TiO2-DOX NPs组荧光强度比游离DOX 高2.3倍，随着时间推移越来越多的纳米颗粒沉积在肿瘤部位，且无论是否有外部磁场存在，都在肿瘤部位观察到明亮的荧光，但在外部磁场作用下，肿瘤中的荧光更亮，表明Fe3O4@TiO2-DOX NPs 具有良好的磁靶向性和持久性。在体内实验Fe3O4@TiO2-DOX NPs +SDT 组肿瘤抑制率最高，提示二者联合具有协同治疗效应。超声波辐照产生的微射流在细胞膜上生成可逆或不可逆性小孔即超声波的声孔效应，导致细胞膜通透性增加，促进化疗药物的释放和进入细胞，增强抗肿瘤效应。纳米颗粒由于其复杂的纳米结构和大的表面积体积比，广泛应用于化学偶联或物理包埋各种化疗药物，通过被动积累或主动靶向方法靶向进入肿瘤[33]。纳米颗粒促进SDT与化疗联合，具有协同效应，对于化疗药物的靶向输送，增强靶区药物浓度及疗效，实现多功能化治疗方面有重要作用。

SDT的治疗效果通过超声、MRI、CT进行实时监测与评估。纳米颗粒可以用作超声对比剂（ultrasound contrast agents，UCA）进行对比增强成像，制备固体二氧化硅纳米颗粒，可显著提高成像对比度、精度及亮度，从而优化治疗效率[34]。MARTINEZ 等[35]将全氟碳气体填充到中空二氧化硅纳米颗粒中，可增强乳腺组织的超声成像，纳米颗粒表面偶联曲妥珠单抗，可增强乳腺癌彩色多普勒超声成像效果及对比度，便于早期诊断。超顺磁性纳米颗粒通过增强磁共振成像信号，表现出高度敏感的MRI对比功能，并提供实时成像，在靶向治疗期间大大提高了诊断准确性。MALVINDI 等[36]制备超顺磁纳米颗粒包封二氧化钛，能够特异性聚集于靶区，进行磁共振T2 加权和超声双模成像，有助于定点治疗和疗效监测。纳米颗粒进行双模及多模态成像用于SDT的早期诊断和精准显影，将多种影像技术相结合，对实现精准医疗具有很高应用价值。

4 问题与展望

纳米医学的快速发展为临床疾病的治疗提供了更为有效的途径，纳米颗粒联合声动力疗法，具有增强治疗效改善患者预后的巨大潜力。然而，从实验研究转化为临床治疗仍然是一条漫长且具有挑战性的道路。研发对超声敏感的光声纳米颗粒及增加纳米颗粒载药量，保持生物持久性和相容性仍是发展的关键点。纳米颗粒能负载治疗药物（如核素、阿霉素、紫杉醇、siRNA、DNA 等），促进SDT与放疗、化疗、光热治疗、基因治疗相结合，实现协同治疗。纳米颗粒的多模态成像适用于个性化监测体内肿瘤、靶向治疗和检测治疗结果等方面，综合不同成像方式的优势，可以更好地了解疾病的状态及预后。相信，纳米颗粒联合声动力治疗将在临床诊断及治疗中，具有广阔而深远的应用前景。