结直肠癌组织中自噬相关蛋白Beclin1和p62的表达特点及意义

张晨红 章礼久 宋莎莎

安徽医科大学第二附属医院消化内科（合肥230601）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全世界范围内癌症相关死亡的第二大常见原因[1]，在我国位居恶性肿瘤病死率第5位[2]，近年来其发病率及病死率均呈上升趋势，其发病机制尚未明了。近年来许多研究提示细胞自噬与结直肠癌的发生发展密切相关[3]，已成为肿瘤防治领域研究的一个热点。细胞自噬受多种自噬相关基因的调控，这些自噬相关基因编码的蛋白质在肿瘤的发生发展阶段起着重要的作用。其中Beclin1、p62是近几年研究较多的与自噬有关的蛋白。Beclin 1 基因属于自噬相关基因，由其编码的Beclin1蛋白，是调节自噬的蛋白，通过与Class ⅢPI3K 相结合来介导自噬体的形成[4]。研究显示Beclin1表达异常与胃癌、肺癌、宫颈癌的发生有关[5-9]。p62是一种重要的自噬底物蛋白，主要功能是参与蛋白泛素化及衰老、受损细胞器的循环周转，p62 异常累积提示细胞受损[10]，很多恶性肿瘤的发生发展与p62的表达异常关系密切[11]。本次研究通过检测自噬相关蛋白Beclin1和p62在结直肠癌和癌旁黏膜组织中的表达，判断自噬活性在肿瘤中的高低，并结合相关临床及病理资料进行分析，探讨自噬与结直肠癌的发生、发展、侵袭和转移之间的关系，为结直肠癌的早期诊断、恶性程度判定、预后评估等提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集78例2018年1月至2019年2月于安徽医科大学第二附属医院普外科行手术切除治疗的结直肠癌患者的组织标本，并获取癌旁黏膜组织标本（距结直肠癌病灶位置＞5 cm）作为对照组。其中男47例，女31例；年龄45～80岁，平均年龄（61.2±4.2）岁。所有病例术前均未行任何放、化疗，并且无合并其他部位恶性肿瘤。组织标本经4%多聚甲醛固定保存。

1.2 主要试剂Beclin1 兔多克隆抗体、p62 鼠单克隆抗体，购于美国AB-CAM公司。三步法免疫组化检测试剂盒、DAB 显色试剂盒，均购于北京中杉公司。

1.3 免疫组化染色采用免疫化学组织SP 法。组织标本经4%多聚甲醛固定后行组织切片。二甲苯脱蜡至水：依次80%，90%，100%二甲苯及乙醇各7 min，然后水洗。将切片置于3%H2O2、室温10 min 以灭活内源性酶后蒸馏水洗3次。将切片浸入PBS（pH7.2-7.6），枸橼酸或EDTA（PH8.0），微波炉加热至沸腾后断电，间隔10 min后，反复2次，自然冷却至室温。滴加5%BSA 封闭液，37℃孵育30 min后甩去多余液体，不洗。滴加稀释的一抗（PBS 或专门的一抗稀释液），37℃孵育2 h后PBS（pH7.2～7.6）洗5 min×3次。滴加相应的二抗，37℃孵育30 min后PBS（pH7.2～7.6）洗5 min× 3次。滴 加SABC，37℃孵 育30 min后PBS（pH7.2～7.6）洗5 min × 4次。DAB 显色，镜下控制反应时间，一般在15 min 以内，后蒸馏水洗涤。苏木素轻度复染1 min，返蓝，烘干后中性树胶封片后显微镜下观察。

1.4 免疫组化染色结果判定根据染色阳性细胞百分比和阳性细胞着色强度两项评分综合判断结果。阳性细胞百分比：无阳性为0 分，0%～25%为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3 分，≥76%为4 分。染色强度按颜色深浅计分：无着色为0分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。两项相加为综合评分：0 分为阴性，1～2 分为弱阳性（+），3～4 分为中度阳性（++），5～6 分为强阳性（+++）。将上述两者得分相乘≤2为阴性，＞2为阳性。

1.5 统计学方法采用SPSS 21.0软件进行统计分析。计数资料以率（%）表示，计量资料采用均数±标准差表示。组间比较采用χ2检验。以α =0.05为检验水准，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Beclin1、p62在结直肠癌和癌旁组织中的表达Beclin1在结直肠癌和癌旁组织中的阳性表达率分别为29.5%（23/78）、71.8%（56/78），p62的阳性表达率分别为52.6%（41/78）、23.1%（18/78）。Beclin1在结直肠癌中的阳性表达率显著低于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。p62在结直肠癌中的阳性表达率显著高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

2.2 Beclin1、p62的表达与结直肠癌临床病理学参数的关系由表2可知，Beclin1在结直肠癌组织中的表达与患者的性别、年龄、组织学分型、分化程度无关（P＞0.05），而与结直肠癌的肠壁浸润深度及淋巴结转移有关。在肠壁浸润深度T1～T2 期中Beclin1的阳性表达率为39.1%（18/46），T3～T4 期中Beclin1的阳性表达率为14.3%（5/32），差异有统计学意义（χ2=5.015，P=0.025）；在无淋巴结转移中Beclin1的阳性表达率为40.4%（21/52），有淋巴结转移中Beclin1的阳性表达率为7.7%（2/26），差异有统计学意义（χ2=8.910，P=0.003），提示Beclin1在结直肠癌中的表达与肠壁浸润深度和淋巴结转移情况呈负相关。p62在结直肠癌组织中的表达与性别、年龄、组织学分型、分化程度、肠壁浸润深度无关，而与结直肠癌的淋巴结转移有关，无淋巴结转移中p62的阳性表达率为34.6%（18/52），有淋巴结转移中p62的阳性表达率达88.5%（23/26），差异有统计学意义（χ2=20.156，P= 0.000），提示p62在结直肠癌中的表达与淋巴结转移情况呈正相关。

图1 免疫组织化学结果（SP 400×）Fig.1 Immunohistochemistry staining

表2 Beclin1、p62的表达与结直肠癌临床病理学参数的关系Tab.2 Relationship between expression of Beclin1 and p62 and clinicopathological parameters of colorectal cancer例（%）

3 讨论

自噬是细胞在自噬相关基因（autophagy related gene，ATG）的调控下利用溶酶体对自身“异常结构”（如衰老的线粒体、内质网及异常蛋白质等）进行消化降解的过程，为细胞代谢循环及细胞器更新提供原料和能量，它是细胞适应内外环境所需的基本调节方式，在维护细胞稳态方面发挥着重要的作用，自噬水平的异常可能会打破细胞原有的平衡状态，从而引发肿瘤等疾病。自噬在肿瘤的研究中引起关注最早是1998年研究发现Beclin1 基因在肿瘤组织中表达的缺失。Beclin1 基因是一种自噬相关基因，定位于人染色体17q21上，分子量为150 kb[12]。自噬相关蛋白Beclin1是肿瘤细胞凋亡、分化和自噬间衔接的重要分子，主要作用于自噬活性激活的细胞程序性死亡的过程，在肿瘤的发生发展中起着重要作用[13]。有研究指出Beclin1是局部晚期结肠癌预后的重要分子标记物[14]。p62是C-myc基因的外显子2和3共同编码的由439个氨基酸组成的一个分子量为62 kD的磷酸化蛋白[15]，也是哺乳动物选择性自噬过程中的特异性底物及调节蛋白[16]，在胃肠道肿瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌和子宫颈癌等肿瘤中都检测到了p62的异常累集。细胞内p62 异常累集可以激活癌基因信号，起到促癌作用，还可以激活核因子相关因子-2（Nfr2）和核因子-кB（NF-кB）这两个活性氧清除系统，使得癌细胞生存能力变强[17]。

本研究显示Beclin1在结直肠癌组织中呈低表达状态，说明在肿瘤细胞中自噬活性降低。自噬活性降低可以引起自噬底物p62的大量聚集，从则导致p62在肿瘤细胞中呈现高表达状态，而本次研究中检测到结直肠癌组织中p62 亦呈高表达状态。国内外有类似本研究结果的报道，赵坚培[18]等采用免疫组织化学法对42例患者的结肠癌组织以及正常结肠黏膜组织中Beclin1 以及p62的阳性表达率进行检测，结果显示Beclin1在正常结肠黏膜中阳性表达率高于癌组织，而p62蛋白则相反。一项研究[19]发现胃癌、结直肠癌组织相对于癌旁组织Beclin1 mRNA和Beclin1蛋白表达水平均下降。以上研究均显示在结直肠肿瘤细胞中自噬活性是降低的，但目前还有一些不同研究结果提示结直肠肿瘤细胞中自噬活性是增强的，马煜等[20]对85例结肠癌组织及其相应距肿瘤组织6 cm 以上的癌旁组织中Beclin1和p62表达的研究显示，在结直肠癌中Beclin1表达增高而p62表达降低。WU 等[21]的研究表明结肠癌组织Beclin1的表达显著高于邻近正常组织。以上所有研究均提示自噬与结直肠癌发生发展关系密切，但造成这些研究结果的不同，可能与研究样本量偏少、实验方法或实验结果评分系统等差异有关，也可能与肿瘤发生的不同阶段自噬对细胞起到了抑制和促进双重作用有关。即在肿瘤发生的早期，细胞自噬功能的缺失可促进肿瘤发生和生长；而在肿瘤晚期，自噬可保护肿瘤细胞在缺血、缺氧等恶劣条件下生存[22]。

本研究还显示Beclin1的表达与结直肠癌的肠壁浸润深度及有无淋巴结转移有关，Beclin1蛋白在T1-T2 期和无淋巴结转移中的阳性率表达高于T3-T4和有淋巴结转移者。p62的阳性率表达与结直肠癌的有无淋巴转移有关，有淋巴结转移者p62表达的阳性率显著高于无淋巴结转移者。目前研究认为决定结直肠癌预后的最关键的因素是临床病理分期，包含肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移及远处转移的综合指标。对肿瘤浸润深度分期越晚、有淋巴结转移者，往往提示患者预后不佳。在临床上将Beclin1、p62 二者联合检测可作为结直肠癌病情严重程度及预后评估的辅助指标，对于Beclin1 低表达、p62 高表达患者可能呈现淋巴结转移率增高，病情晚，预后差。

综上所述，结直肠癌中自噬相关蛋白Beclin1、p62表达异常，可以通过调节细胞的自噬活性来影响肿瘤的发生与进展，将来有望成为结直肠癌早期诊断、恶性程度判定和预后评估的标志物。目前自噬在结直肠癌发生、发展中的作用尚无定论、机制仍未完全阐明，而现阶段国内外有关Beclin1、p62的表达与结直肠癌预后关系报道少见，后者也是本研究的不足之处，故后期我们将继续开展更多样本的重复实验和深入研究，并对现有病人的预后、存活时间继续随访。相信随着研究的深入，细胞自噬在结直肠癌中所起到的作用会越来越明了，对评估结直肠癌预后及在结直肠癌的治疗中具有十分重要的意义，这也为结直肠癌的治疗提供了一个新方向。