下气道菌群结构的变化与婴幼儿喘息的研究

张蕾 艾涛 谢诚 夏万敏 廖惠玲 樊映红 张莹 贾良琴

电子科技大学医学院附属妇女儿童医院·成都市妇女儿童中心医院呼吸科（成都610000）

喘息是儿童时期最为常见的呼吸道症状之一，婴幼儿表现尤为明显。近年来，以喘息为主要表现的疾病发生率在全球范围内呈上升趋势。流行病学调查资料显示，约1/3 儿童在3岁前至少有一次喘息发作，6岁时有将近50%儿童有过喘息发作。而反复喘息可能为早期的哮喘。哮喘是一种常见的且危害儿童健康的慢性呼吸系统疾病，未控制的哮喘不仅影响儿童的健康和学习，而且耽误家长的工作和生活，同时会给社会造成沉重的负担，故应重视早期婴幼儿反复喘息的认识和治疗。儿童哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症疾病，引起的原因是多方面的，包括复杂的环境、免疫和宿主遗传等相关因素。已有大量研究显示，除了遗传和过敏性体质因素外，呼吸道病毒及非典型病原菌的感染是引起喘息甚至导致喘息的最主要的因素[1-2]。

近10年来，随着16S rRNA 扩增后进行测序分析技术的应用，人们可以将微生物分类到种甚至对亚种级别进行分析，已经研究证实下呼吸道并不是无菌的，也隐藏着大量多元微生物。支气管粘膜上的细菌定植并不是单一的菌群，不同呼吸疾病状态下呼吸道菌群的组成也不一样，改变这种共生的状态将会导致包括哮喘在内的呼吸系统疾病的发生[3-6]。但目前关于下气道细菌微生态对喘息的影响研究甚少，本研究检测喘息患儿支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），分析其下呼吸道的菌群谱，结合患儿的临床表现探讨气道微生态与喘息发生的关系，为临床的反复喘息疾病早期干预治疗提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象本研究通过医院伦理委员会审批，选择2018年1至12月成都市妇女儿童中心医院呼吸科就诊的反复喘息（喘息次数≥3次）患儿44例，其中男26例，女18例，年龄6个月至2.5岁。近1周无使用抗生素的病史，无心脏病、肺结核、支气管异物、支气管肺发育不良等疾病及血液检查结果提示免疫功能异常者，影像学检查未提示明显异常。

1.2 术前检查入院后24 h内完成婴儿潮气肺功能（潮气量、达峰时间比、达峰容积比、呼吸频率）、呼出气一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide，Fe-NO）、皮肤点刺试验、血常规等相关检查。

患儿入院后进行纤维支气管镜检查的术前检查，所选患儿均已经控制喘息症状有行纤支镜检查的适应证，并签署支气管镜检查知情同意书。在静脉复合麻醉下经喉罩通气实施镜检术。呼吸科医师沿气管导管或鼻腔插入电子支气管镜依次观察会厌、气管及各段、部分亚段开口，观察病变部位情况。选择肺段进行灌洗，采集的气道分泌物进行细胞计数、细菌培养药敏，余分装后高速离心，15 600 ×g4℃离心30 min，弃上清，细胞沉淀-80℃冻存备用。

1.3 基因组DNA的提取采用CTAB 或SDS 方法对样本的基因组DNA进行提取，-20℃保存留待进一步分析。通过PCR扩增16S V4区引物为515F-806R，使用New England Biolabs 公 司的Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，高效和高保真的酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。扩增条件：98℃预变性1 min；30个循环包括（98℃，10 s；50℃，30 s；72℃，30 s）；72℃，5 min。脂糖胶电泳纯化PCR 产物，选择主带大小在400～450 bp 之间的序列，割胶回收目标条带。产物纯化试剂盒使用的是Thermo Scientific公司GeneJET胶回收试剂盒

1.4 生物信息学分析使用New England Biolabs公司的NEB Next®UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina 建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit 定量和文库检测，合格后，使用HiSeq进行上机测序。基于有效数据进行OTUs（Operational taxonomic units）聚类和物种分类分析，同时，对OTUs进行丰度、Alpha多样性计算、以得到样品内物种丰富度和均匀度信息、不同样品或分组间的共有和特有OTUs 信息等。

1.5 统计学方法所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析进行比较，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料44例研究对象中，具有异质性患儿（皮肤点刺试验阳性、既往医生诊断湿疹、过敏性疾病等）分为（atopy，A）组；无异质性患儿为（normal，N）组；无异质性及纤维支气管镜下检查结果为气道软化、狭窄引起喘息者为（stenosis，S）组。3 组患儿BALF 细菌培养均为阴性，在年龄、性别、BALF细胞计数、血常规分类计数、肺功能、FeNO 值差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 测序数据样本共获得2 918 985条可用的高质量序列，序列平均长度为254 bp，所有样品文库的覆盖率达98%以上，说明每个样品的测序量均已达到饱和。以97%相似度聚类，获得5 408个OTU，图1显示A 组共获得3 364个OTU，B 组共获得3 900个OTU，S 组共获得3 090个OTU，3 组共有1 758个OTU。见图1。

图1 3 组Venn 图Fig.1 Venn diagram of OTU in the 3 groups

2.3 Alpha多样性分析Alpha多样性是对样本中物种多样性的分析，基于OTU 种类和丰度计算ace、shannon 指数。3 组的菌群的丰度及多样性差异无统计学意义（P＞0.05，图2）。

表1 44例患儿的临床特征Tab.1 Epidemiologic characteristics of the 44 children investigated in this study±s

表1 44例患儿的临床特征Tab.1 Epidemiologic characteristics of the 44 children investigated in this study±s

组别例数年龄（月）性别（男/女）BALF 嗜酸细胞百分比（%）BALF 中性粒细胞百分比（%）血液嗜酸细胞百分比（%）血液白细胞数（×106 /g）FeNO（ppb）潮气量（mL/kg）达峰容积比（%）达峰时间比（%）呼吸频率（次/min）A 组16 13.68±6.6 10/6 0.625±1.707 35.5±31.9 1.80±1.49 9.50±3.11 11.62±5.86 8.03±1.29 18.71±4.14 21.38±3.19 32.00±7.03 N 组17 16.42±10.9 9/8 0.294±1.212 24.05±20.84 2.41±1.99 9.98±4.15 10.41±2.98 8.02±1.45 18.81±6.81 21.42±5.14 31.35±1.80 S 组11 9.63±6.28 7/4 0 27.18±26.12 2.16±2.11 9.73±4.40 14.36±7.04 8.12±1.84 19.42±7.16 22.85±5.78 29.45±4.18统计值0.779 0.437 0.794 0.941 0.447 0.687 1.608 0.009 0.05 0.387 0.542 P 值0.446 0.804 0.459 0.398 0.643 0.509 0.213 0.991 0.950 0.652 0.586

图2 3 组Alpha多样性盒形图Fig.2 The boxplot of Alpha diversity index in 3 groups

图3 3 组Beta多样性盒形图Fig.3 The boxplot of Beta index in 3 groups

2.4 菌群结构分析Beta多样性表示的是微生物群落构成的比较，评估微生物群落间的差异，T-test检验发现A 组与N 组、S 组比较存在明显的菌群结构差异（P＜0.05），见图3。3 组从门到属水平的菌种构成的差异见图4。在门水平上，3 组占主导地位的主要包括Proteobacteria 变形菌门、Firmicutes 厚壁菌门、Tenericutes软壁菌门；其中A 组Proteobacteria 变 形 菌 门 较N、S 组 增多，而Firmicutes 厚壁菌门相对较少。在纲水平上主导的为Alphaproteobacteria a-变形菌纲、Gammaproteobacteria γ-变性菌纲、Bacilli 芽孢杆菌纲但A 组Gammaproteobacteria γ-变性菌纲更丰富。在目、科、属水平上A 组的优势物种与N 组、S 组均有不同。

3 讨论

图4 3 组门、纲、目、科、属水平的菌种的构成差异Fig.4 Differences in composition of three groups of species at the level of phylum，class，order，family and genus

因儿童特有的解剖结构、生理发育、免疫特点，喘息在儿童中的发生率很高。学龄前儿童反复喘息的不同表型预后不一，部分喘息表现可以持续到青少年甚至成年，成为哮喘，而反复喘息与哮喘之间的风险因素目前尚不明确，也导致了学龄前儿童哮喘诊断的困难和治疗的不确定。在成人患者中，运用诱导痰细胞计数可将哮喘分为嗜酸性炎症（过敏性与非过敏嗜酸性炎症）、非嗜酸性炎症[6-7]，用于评价气道的炎症及水平，指导临床合理用药。但诱导痰计数在儿童中开展困难[8]，本研究选取BALF细胞计数，欲探讨气道的炎症性质，结果发现3 组的BALF的嗜酸性粒细胞及中性粒细胞均无异常，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究对象均未伴有发热、影像学检查未提示明显异常，年龄、性别、血常规分类计数及肺功能、FeNO 等方面差异均无统计学意义（P＞0.05），单纯从临床表现很难区别喘息的表型。也进一步说明儿童不单纯是成人的缩影，检查的局限性及可信性妨碍了对反复喘息的正确认识和合理治疗，导致发病率逐年上升。

初生婴儿气道为无菌的，但随着年龄的增长、环境的变化气道微生态也会发生改变，几项研究已经证明肺部在无外界感染的环境下并不是无菌的[9]。气道微生态的变化与许多呼吸道疾病发生相关[10-11]。痰液样本检测发现婴幼儿早期流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌感染与反复喘息相关，并且与健康婴儿相比，喘息婴儿上气道的菌群构成不一样[2]。但下气道的菌群与上气道菌群不一致，随着气道的延伸，菌群的数量有减少，种类及结构均有改变[12-14]。目前下气道菌群的研究资料相对缺乏，国内外少有下气道菌群与儿童喘息的研究。因为伦理的原因，本研究未能收集健康儿童下气道的BALF进行研究，将因气道软化或狭窄出现喘息的儿童作为研究对照组（S 组），比较3 组儿童的下气道菌群的丰度及多样性，差异无统计学意义（P＞0.05），证明3 组患儿下气道细菌的含量及种类是一致的，结合BALF 未培养出细菌且中性粒细胞计数在正常范围内，认为通过16S rRNA扩增后进行测序检测出的细菌为定植菌而不是感染菌。但有异质性喘息的儿童（A 组）与其余两组比较有明显的菌群结构的变化（P＜0.05）。而无异质性喘息儿童（N 组）与因气道软化出现喘息儿童（S 组）的下气道菌群结构差异无统计学意义（P＞0.05）。在门水平上，3组占主导地位的菌群主要包括Proteobacteria 变形菌门、Firmicutes 厚壁菌门、Tenericutes软壁菌门；与国外报道健康成人的下气道主导菌群一致[10]。但A 组的Proteobacteria变形菌门较N 组及S 组更高，Proteobacteria 变形菌门在成人哮喘患者气道中同样增多[15-16]。而A 组的Firmicutes 厚壁菌门相对减少，国外学者通过成年鼠的动物实验发现厚壁菌门可以防止气道嗜酸细胞性炎症[17]。因此笔者认为下气道菌群结构的改变与哮喘的发生是有关联的，具有异质性的喘息儿童也更容易发展成哮喘。生命早期的气道菌群的失衡，可导致气道黏膜生理机制的变化，出现免疫功能的改变[17-21]。相同的呼吸道病毒感染可能为喘息的促发因素，A 组患儿较其他两组组患儿更可能出现气道的高反应，甚至发展成哮喘，不排除A 组患儿气道菌群的失调而促进了免疫失衡的结果。而环境的保护、抗生素的合理使用均可防止气道菌群的失调，有利于控制反复喘息及哮喘的发生。

本研究不足之处，其一、研究数量少、研究对象年龄范围相对局限；其二、未能完善总IgE及sIgE 检查，对于异质性体质的区别存在不足。因此进一步寻找气道微生态的有益细菌，维持合理的菌群结构，预防喘息及哮喘的发生，需要笔者更大范围、更大样本量、更长时间的观察随访以期得出更准确的结论。