基于NOD2信号通路探讨NADPH抑制剂对肾脏缺血再灌注损伤的影响

张晓林 刘文丽 李光远 马芳 夏田雨 李迪 张哲 覃志成

030001 太原，山西医科大学第二医院肾内科(张晓林，夏田雨，李迪，张哲)；831399 新疆，新疆五家渠人民医院肾内科(刘文丽，李光远，马芳)；030012 太原，山西省人民医院肾内科(覃志成)

急性肾损伤(AKI)是以肾功能短期内急剧下降为特征的临床综合征，具有较高的发病率及死亡率[1]。肾脏缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，IRI)是急性肾衰竭发生的重要病理生理基础[2]。而氧化应激作为肾脏IRI的关键致病机制之一，可导致肾脏实质细胞和间质细胞的空泡样变性、坏死及凋亡[3]。核苷酸寡聚化结构域蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-2，NOD2)受体是一类新型的胞浆内固有免疫模式识别受体，表达于人和鼠肾小管上皮细胞，在IRI发生时NOD2受体的激活可引起炎症因子及趋化因子的产生，导致AKI[4]。

本实验采用两种公认的NADPH氧化酶抑制剂4-羟基-3甲氧基苯乙酮(4-hydroxy-3-methoxyacetophenone，Apocynin)和氯化二碘联苯(diphenylene iodonium，DPI)对IRI模型大鼠进行预处理，观察是否可通过抑制氧化应激来介导肾小管上皮细胞NOD2信号通路的抑制，从而减轻IRI过程。现报道如下。

材料与方法

一、实验材料

选取健康雄性Wistar大鼠24只，由山西医科大学动物中心提供，质量为180～210 g之间，常规饲养，禁食12 h后用于实验。主要实验试剂：Apocynin及DPI(Sigma公司)；兔抗大鼠NOD2(Boster公司)，抗核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)(Bioss公司)，抗半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)(Boster公司)，抗IL-1β(Bioss公司)，抗GAPDH抗体(江苏凯基生物技术股份有限公司)。

二、实验方法

1.分组 取24只雄性Wistar大鼠，通过腹腔注射10%水合氯醛(剂量为0.3 mL/100 g)进行麻醉，分离肾蒂周围组织，暴露左肾动脉，结扎右肾蒂，切除右肾，并随机分为假手术组(Sham组)、肾脏缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)组、I/R+Apocynin组、I/R+DPI组，每组6只。其中，I/R+Apocynin组大鼠采用Apocynin以10mol/min的速度，连续10 min从左肾动脉注射，停药3 min后用无损伤微动脉夹夹闭大鼠左侧肾蒂，45 min后解除阻断，建立大鼠IRI模型；DPI组大鼠采用DPI以1mol/min的速度，连续10 min从左肾动脉注射，停药3 min后用无损伤微动脉夹夹闭大鼠左侧肾蒂，45 min后解除阻断；I/R组大鼠给予等体积生理盐水，停药3 min后用无损伤微动脉夹夹闭大鼠左侧肾蒂，45 min后解除阻断；Sham组给予等体积生理盐水，不予夹闭左肾动脉。各组大鼠于试验结束24 h后收集血及肾组织标本。

2.Western blot检测 采用Western blot检测NOD2、NF-κB蛋白、caspase-1表达，取液氮中保存的肾组织每组各取约90 mg加入适量蛋白裂解液匀浆，离心取上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。每组取30 μg蛋白于SDS-PAGE凝胶电泳，转入NC膜；5%的脱脂奶粉封闭2 h后加入抗NOD-2及抗NF-κB(1∶2 000)、抗caspase-1(1∶2 000)，4 ℃过夜；TBST洗膜，加入HRP标记的二抗(1∶20 000)，室温下孵育l h；ECL化学发光法曝光。以GADPH为内参照，通过计算目标蛋白与GADPH的灰度比值进行半定量分析。

3.实时定量PCR法检测 采用实时定量PCR法检测NOD2 mRNA的表达。用Trizol试剂提取组织中总RNA。使用上海宝生物Takara反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。实时定量PCR采用SYBR Green Master Mix试剂盒进行，每管总反应体积25L，PCR温度循环设计：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min循环40次。待测样品mRNA相对表达量=2-ΔΔCt×100%，以GAPDH标化各mRNA拷贝数。

4.组织病理学检查 将大鼠肾组织切片3 μm厚，HE染色处理后，通过计数肾小管损伤面积的百分比，半定量评估肾小管间质损伤程度，评分标准根据肾小管上皮细胞变性、坏死、刷状缘脱落、管型形成及炎细胞浸润程度分为：0分(无损伤)、1分(≤10%)、2分(11%～25%)、3分(26%～45%)、4分(46%～75%)、5分(>76%)。每张切片至少选10个皮髓交界部视野观察。

5.免疫组织化学法检测 采用免疫组织化学法检测肾内炎性因子IL-1β的表达。使用SABC法，一抗为兔抗大鼠IL-1β单克隆抗体(1∶200)。用JD-801计算机图像分析系统分析各目的蛋白的半定量表达水平。每张切片上随机选取6个视野，以平均吸光度计算蛋白表达量。

三、统计学处理

结 果

一、各组大鼠肾组织NOD-2、NF-κB、caspase-1蛋白相对表达量比较

与Sham组相比，I/R组大鼠肾组织NOD2、NF-κB、caspase-1蛋白表达均增加，差异有统计学意义(P<0.05)；而与I/R组相比，I/R+Apocynin组和I/R+DPI组NOD2、NF-κB、caspase-1蛋白表达均减少，差异有统计学意义(P<0.05)。(图1)

注：Sham为假手术组，I/R为肾脏缺血再灌注组，Apocynin为肾脏缺血再灌注+Apocynin处理组，DPI为肾脏缺血再灌注+DPI处理组；与sham组比较，aP<0.05；与I/R组比较，bP<0.05图1 各组大鼠肾组织NOD-1、NF-κB、caspase-1蛋白相对表达量比较

二、各组大鼠肾组织NOD2 mRNA相对表达量比较

与Sham组相比，I/R组大鼠肾组织NOD2 mRNA表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与I/R组相比，I/R+Apocynin组、I/R+DPI组的大鼠肾组织NOD2 mRNA表达均减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。(图2)

注：Sham为假手术组，I/R为肾脏缺血再灌注组，Apocynin为肾脏缺血再灌注+Apocynin处理组，DPI为肾脏缺血再灌注+DPI处理组；与sham组比较，aP<0.05；与I/R组比较，bP<0.05图2 各组大鼠肾组织NOD2 mRNA相对表达量比较

三、各组大鼠肾脏病理情况比较

与sham组比较，I/R组肾小管损伤程度评分较高(P<0.05)，HE染色下显示肾小管上皮细胞水肿、坏死，脱落于管腔，肾小管管腔扩大，肾间质有炎性细胞浸润程度明显增大；与I/R组比较，I/R+Apocynin组、I/R+DPI组肾小管损伤程度评分较低(P<0.05)，HE染色显示急性肾小管坏死程度减轻。(图3)

注：Sham为假手术组，I/R为肾脏缺血再灌注组，Apocynin为肾脏缺血再灌注+Apocynin处理组，DPI为肾脏缺血再灌注+DPI处理组；与sham组比较，aP<0.05；与I/R组比较，bP<0.05图3 各组大鼠肾脏病理情况比较(HE，×200) A.假手术组；B.I/R组；C.I/R+Apocynin组；D.I/R+DPI组；E.各组肾小管损伤评分

四、各组大鼠肾组织炎性因子IL-1β相对表达量比较

免疫组化结果显示，sham组肾组织IL-1β仅少量炎性因子IL-1β表达；与sham组相比，I/R组大鼠肾组织IL-1β表达明显增加(P<0.05)；与I/R组相比，I/R+Apocynin组、I/R+DPI组IL-1β表达显著减少(P<0.05)。(图4)

注：Sham为假手术组，I/R为肾脏缺血再灌注组，Apocynin为肾脏缺血再灌注+Apocynin处理组，DPI为肾脏缺血再灌注+DPI处理组；与sham组比较，aP<0.05；与I/R组比较，bP<0.05图4 各组大鼠肾组织IL-1β相对表达量比较 A.假手术组；B.I/R组；C.I/R+Apocynin组；D.I/R+DPI组；E.各组IL-1β蛋白表达量

讨 论

肾脏IRI是一种复杂的病理生理事件，是AKI最常见原因。在IRI中，氧化应激是诱导组织损伤的关键致病机制。正常情况下，细胞中氧化剂和抗氧化剂的产生之间处于平衡状态。当氧化剂产生增加，内源性抗氧化剂耗尽，可导致细胞损伤、蛋白质功能障碍、DNA及脂质的损害[5]。在IRI中，氧化应激直接产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，当ROS产生超过机体抗氧化能力时，可氧化破坏生物分子和生物膜，诱导肾小管细胞损伤[6]。NADPH氧化酶(NOX)是产生ROS的重要来源，NOX催化电子从NADPH转移到分子氧，通过NOX催化亚基，产生ROS，参与机体生理和病理生理过程[7]。在几种IRI模型中使用ROS清除剂可导致组织损伤程度显著降低[8-9]。本课题组前期研究也证明，使用硫化氢抑制肾脏中NOX2、NOX4的活化，降低ROS产生，可以增加组织抗氧化能力，减轻脂质过氧化，从而降低肾脏氧化损伤[10]。

动物的先天免疫主要是通过模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)识别疾病相关分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMPs)实现的。PRR的代表为膜结合受体(例如Toll样受体)及胞质内受体(例如NOD样受体)。NOD样受体作为一类新型胞浆内的固有免疫模式识别受体，在自身免疫调节中起重要作用，它可识别细菌肽聚糖，活化NF-κB、caspase，诱导多种炎症因子及趋化因子的分泌，从而介导炎症反应[11]。NOD2在小鼠肾小管上皮细胞、系膜细胞和足细胞及人的肾小管上皮细胞、肾小球内皮细胞上都有表达[4,12]。有研究表明，在肾脏IRI中，肾小管上皮细胞NOD2受体表达增多，引起NF-κB、caspase-1活化，导致IL-1β等炎症因子的产生，从而诱导细胞死亡信号，加重肾脏的损伤[4]。

而本实验结果显示，在肾脏IRI模型大鼠中，检测到NOD2蛋白、NOD2 mRNA表达、NF-κB、caspase-1、炎症介质IL-1β表达均增高，肾组织损伤严重，说明在IRI时，可能通过激活NOD2信号通路，活化NF-κB，诱导炎症介质的产生，导致AKI。这与已有的研究结果相似[4]。有研究表明，NOX可作为IRI的治疗靶标，使用抗氧化剂可减轻肾脏IRI[13]。阻断特异性PRR(如TLR2、NOD1、NOD2)对缺血性肾小管上皮细胞损伤有非常显著的保护作用[14]。本实验结果显示，给予NOX抑制剂Apocynin和DPI处理后，大鼠NOD2、NF-κB、caspase-1、炎症介质IL-1β的表达较I/R组减少，肾小管病理损伤也明显减轻，说明抑制氧化应激可阻断NOD2样受体依赖的炎症途径，抑制NF-κB蛋白的产生，减少炎症介质的分泌，减轻IRI过程，这可以为肾脏IRI治疗提供新的理论依据。