超声处理对肌原纤维蛋白凝胶特性和结构的影响

刁小琴，关海宁，乔秀丽，刘东琦，刘旺

绥化学院食品与制药工程学院（绥化 152061）

超声波技术因具有操作效率高、成本低、绿色环保等优点被广泛应用于食品领域[1]。它通过产生的机械、空化、热和化学效应对食品中的大分子进行改性，不仅可以改变其理化特性，同时还可以改变结构，效果显著[2-3]。肌原纤维蛋白是猪肌肉的重要组成成分之一，具有持水性、乳化性以及凝胶性等多重功能特性。蛋白质的凝胶特性在肉制品加工中决定成品的质构和感官。张崟等[4]报道超声波处理能提高鱼糜凝胶强度，Madadlou等[5]也报道超声处理能够提高酪蛋白凝胶的硬度，江连洲等[6]采用超声处理大豆分离蛋白与肌原纤维蛋白复合体系，结果发现超声功率400 W、超声时间20 min时，复合体系凝胶的硬度提高。Zisu等[7]采用20 kHz的超声探头处理乳清蛋白和酪蛋白，结果也发现2种蛋白的凝胶性增加。

国内外尚未有关于猪肉肌原纤维蛋白经超声波处理后凝胶特性的改善研究报道，因此试验拟通过超声波技术对MP进行处理，研究其凝胶特性及结构的变化，以期为超声波技术进一步应用于肌原纤维蛋白，改善其功能特性提供理论依据，并为进一步提高乳化型凝胶肉制品的品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜的猪背最长肌（黑龙江北大荒肉业有限公司）；大豆色拉油（安徽中粮油脂有限公司）；乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）（北京华迈科生物技术有限责任公司）；哌嗪-1, 4-二乙磺酸（PIPE，上海麦克林生化科技有限公司）；牛血清蛋白（北京索莱宝科技有限公司）。

酒石酸钾钠、无水硫酸铜、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠等（均为国产分析纯）。

1.2 仪器与设备

超声波发生器（KQ-100 VDB型，昆山市超声仪器有限公司）；高速冷冻离心机（GL-21 M型，湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；TA-XT plus质构仪（英国Stable Micro System公司）；CR-5色差计（日本柯尼卡美能达）；AVATAR 360傅立叶变换红外光谱仪（美国Nicolet公司）；S-3400 N型电子扫描电镜（日本日立公司）；DK-S 24型电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 肌原纤维蛋白的制备

参照Xia等[8]的方法从猪背最长肌中提取肌原纤维蛋白，以牛血清蛋白为标准品，采用双缩脲法进行测定。

1.3.2 肌原纤维蛋白的超声处理

将1.3.1得到的肌原纤维蛋白用50 mmol/L PIPES（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.0）溶液配成浓度40 mg/mL，分成4份，分别装于50 mL烧杯中，置于不同超声功率（80，140，180和200 W）的超声波清洗器中，超声处理40 min，冰水浴控制温度4～10 ℃，以不做超声处理为对照。

1.3.3 凝胶的制备

将超声处理后的肌原纤维蛋白倒入25 mm×40 mm（直径×高度）密封的玻璃瓶，于4 ℃条件下平衡过夜，次日取出室温平衡30 min，放入72 ℃水浴加热10 min，立即取出冰浴冷却，一部分用于凝胶强度、白度、持水性、持油性及扫描电镜的测定，另一部分凝胶真空冷冻干燥，用于红外分析。

1.3.4 凝胶强度的测定

凝胶强度的测定使用质构分析仪，探头类型为P/0.5直径12 mm，前进速度1 mm/s，穿刺距离10.0 mm，穿透力即为凝胶的强度[9]。

1.3.5 凝胶白度的测定

使用ZE-6000色差计测定，整个样品池底部要求填满凝胶并且无空隙，将样品池底部放在载物台上进行颜色和光泽的测定。每个样品顺着一个方向旋动3次，测定3次，取平均值。分别记录L*值、a*值和b*值。白度按式（1）计算.

1.3.6 凝胶持水性和持油性的测定

称取5 g凝胶样品（m1）放入离心管中，在4 ℃下以10 000×g离心15 min，倒出渗出的液体，凝胶表面残余的水分用滤纸吸干，称质量（m2）。凝胶持水性（WHC）按式（2）计算。

称取1 g凝胶样品（m0），放入离心管中称质量（m1），加入5 mL大豆色拉油，用漩涡振荡器混合5 min，室温静置30 min后，以4 000 r/min离心20 min，倒出上层色拉油，称质量（m2）。持油性计算如式（3）。

1.3.7 扫描电镜观察

参考Diao等[10]的方法处理凝胶样品。处理好的样品通过真空冷冻干燥机干燥后，选择截面平缓的样品逐个粘贴在扫描电镜样品台上，表面喷金镀膜后于扫描电镜（SEM）在放大倍数2 000倍条件下观察微观结构，加速电压为5 kV。

1.3.8 红外光谱分析

真空冷冻干燥后的凝胶粉末与溴化钾研磨混合均匀，压片机压片，恒温箱里平衡5 min，空气作为扫描背景，红外光谱仪扫描，扫描范围4 000～600 cm-1，分辨率4 cm-1，信号扫描累加64次，每个样品图谱扫描重复3次，采集红外光谱图。

1.4 数据统计分析

每个试验结果均用平均数±SD表示。差异显著性分析采用Statistix 8.1软件进行，作图采用Sigmaplot 12.5软件。

2 结果与分析

2.1 超声功率对凝胶强度的影响

凝胶强度是凝胶的一个重要品质特性，好的凝胶特性不仅可以提高肉制品的品质，还可以提高产品的得率。图1可知，经过超声处理后，肌原纤维蛋白的凝胶强度呈先上升后下降趋势。经过超声处理后的肌原纤维蛋白凝胶强度明显高于天然的肌原纤维蛋白凝胶强度，超声功率180 W，凝胶强度最大。这可能是因为超声波处理可以减小蛋白质分子粒度，促进肌原纤维蛋白形成致密均匀的凝胶网络结构，使凝胶强度增加。随着超声功率增大，蛋白质分子的膨胀和疏水残基的暴露，增加蛋白质分子间在凝胶过程中的相互作用。当超声功率过高时，较高的超声功率破坏蛋白分子间作用力，从而使其结合能力降低，进而凝胶强度降低。包中宇[11]研究表明经超声波处理后，TG酶改性的大豆分离蛋白凝胶强度先升高后降低。Zhao等[12]研究也表明低强度的超声波处理能增加鸡肉肌原纤维蛋白与大豆油乳化液形成的复合凝胶强度。

图1 超声功率对肌原纤维蛋白凝胶强度的影响

2.2 超声功率对凝胶持水性的影响

凝胶的持水性影响凝胶制品的嫩度和多汁性。图2可知，肌原纤维蛋白凝胶的持水能力随超声功率的增加先增大后减小，未超声处理的样品具有较低的持水性，为43.94%，180 W超声处理的样品具有最高的持水性，为58.09%，超声功率200 W，持水性下降为51.71%。原因可能是经超声处理后，肌原纤维蛋白之间作用力增加，凝胶结构更加致密，保水能力增强。超声功率增加至200 W时，持水性有所下降，可能是由于超声功率的增加，使部分蛋白质发生变性，进而使持水性下降。常海霞等[13]研究超声处理草鱼肌原纤维蛋白的结果也表明持水性呈先上升后下降趋势。Puppo等[14]研究发现凝胶具有较高的持水性与其致密均匀的结构有关，在凝胶微观结构图像中也证实这一结论。

图2 超声功率对肌原纤维蛋白凝胶持水性的影响

2.3 超声功率对凝胶持油性的影响

持油性指蛋白质产品与油脂吸附结合的程度，进而减少肉制品在蒸煮时脂肪的损失。图3可知，超声处理后肌原纤维蛋白凝胶的持油性有所提高，且随着超声功率增加，持油性呈先上升后下降趋势，未超声处理的样品具有最低的持油性，为8.41%，经180 W超声处理的样品具有最高的持油性，为28.36%，超声功率200 W时，持油性下降为22.11%。经过超声处理，蛋白质分子结构破坏，二硫键及疏水基等功能基团暴露，与脂类物质的结合能力增强，从而使肌原纤维蛋白的吸油能力增强。然而由于超声波功率的增加，蛋白质变性，继而导致持油性下降，但仍高于天然的肌原纤维蛋白。

图3 超声功率对肌原纤维蛋白凝胶持油性的影响

2.4 超声功率对凝胶白度的影响

凝胶白度决定凝胶的外观品质，图4可知，随着超声功率增加，凝胶的白度先增大后减小。超声功率180 W时，凝胶白度最高，超声功率200 W时，凝胶白度降低，但仍高于未经处理的样品。这可能是由于超声处理后凝胶的持水性增加，使凝胶光泽度和透明度增加。

图4 超声功率对肌原纤维蛋白凝胶白度的影响

2.5 超声功率对凝胶微观结构的影响

凝胶的微观结构决定凝胶的物理性质，图5看出，未经超声处理的蛋白凝胶呈现出较大的不规则孔穴，随着超声功率增加，肌原纤维蛋白凝胶的空间网络结构变得均匀、致密，超声功率180 W时，凝胶网络细腻，孔洞较小，表面较为平整，这可能是超声波的空穴和机械效应减小了蛋白质分子的粒度，进而促进肌原纤维蛋白形成致密均一的凝胶网络结构，超声功率200 W时，凝胶网孔再次变大，可能是较高的超声功率破坏蛋白质之间疏水相互作用。有研究表明蛋白的凝胶强度、持水性均与凝胶的空间网络结构有关[7,14]，试验观察到的肌原纤维蛋白凝胶的微观结构与凝胶的持水性和凝胶强度的研究结果一致。

图5 超声功率对肌原纤维蛋白凝胶微观结构的影响（电镜照片2 000×）

2.6 红外光谱分析

为了考察超声波对肌原纤维蛋白二级结构的影响，用红外光谱分析凝胶中蛋白分子的官能团和氢键的变化。蛋白质的红外吸收光谱由系列酰胺带组成，其中酰胺I带（1 600～1 700 cm-1）对蛋白质结构分析最重要。由图6看出，超声波处理后的肌原纤维蛋白与未经超声处理的蛋白在酰胺I带具有相同的特征吸收峰，然而与未经超声处理的肌原纤维蛋白相比，利用超声功率180 W处理的肌原纤维蛋白其振动强度最大，二级结构变化最为显著。酰胺A带（3 300～3 270 cm-1）的吸收峰与N—H和O—H的伸缩振动相关，吸收峰的变化受氢键的影响。随着超声功率增强，酰胺A波段吸收峰变宽，且伸缩振动频率增强，说明超声波引起蛋白分子结构变化，使其在形成凝胶的过程中蛋白分子内和分子间的氢键增强，其中180 W处理的肌原纤维蛋白的吸收峰最宽，伸缩振动最强。王立等[15]研究发现超声辅助提取的鸡肝蛋白二级结构也发生显著变化。

图6 超声处理肌原纤维蛋白凝胶的红外光谱分析

3 结论

采用超声波技术对猪肉肌原纤维蛋白进行改性具有一定效果，一定功率超声处理能提高肌原纤维蛋白的凝胶强度、持水性、持油性及白度。超声功率较强时会破坏蛋白分子间作用力，进而使各性质指标下降。超声功率180 W时，形成的凝胶网络结构均匀、致密、孔洞较小，同时该功率处理的肌原纤维蛋白二级结构变化最为显著。因此，采用适宜超声功率可提高肌原纤维蛋白的凝胶特性，然而关于超声作用时间、超声作用频率等超声波改性技术对MP凝胶及高级结构的影响有待进一步研究。