蓝圆鲹多肽亚铁螯合物制备及其抗氧化性

肖玉娟，傅奇，何少贵*，林慧霞，杨燊

1. 厦门华厦学院环境与公共健康学院（厦门 361024）；2. 集美大学食品与生物工程学院（厦门 361021）

蓝圆鲹又称池鱼、巴浪鱼，是中国东南沿海重要经济鱼类之一。据统计，蓝圆鲹的年产量仅次于带鱼和鳀鱼，为中国第三大海洋捕捞鱼类[1]。

星雨将“石压蛤蟆”“死蚯蚓”“大道曰返”讲给李离听，李离也笑得前仰后合，一边又正色对星雨讲：“颜老师的字雄秀独出，一变古法，兼收汉魏晋宋以来风流，我朝书法名家，没有谁超过他的。字如其人，他格力天纵，神乎其神，难以预测！练百花拂穴手中的‘快雪时晴’‘钟林毓秀’，都应体会书圣的笔意！”星雨听得半懂不懂，只是觉得颜师父的课虽然没什么意思，但这些促狭师兄太有意思了……

铁是人和动物体所必需的微量元素之一，严重缺铁时不仅发生贫血，也可引起体内含铁的酶类缺乏，导致细胞呼吸发生障碍，影响组织器官的功能[2]。越来越多的人认为多肽亚铁螯合盐是人和动物铁吸收的主要机制[3-5]。此外，国外有研究表明多肽螯合物还具有自由基清除活性[6-8]，国内近年来在多肽螯合产物方面进行较多研究[9-13]，也发现其具有一定自由基清除作用。

亨斯迈纺织染化通过研发可持续发展产品，得到较快发展，扩大了在中国市场的份额。她以研发的新一代染料产品AVITERA SE为例解释道，该产品不仅完全符合中国环保要求，还可以帮助下游企业大幅度降低水和能源的消耗。用这种染料染棉织物可让染厂比传统高温或中温染整方法减少50%耗水量、70%耗能量、20%用盐量，节省50%时间，既降低了成本，减少了水电煤用量，又降低了排污，在市场上很受欢迎。

MS包含了一系列促进心脑血管疾病发生发展的危险因素，而且多呈高水平、多重聚集状态，从而使心脑血管疾病的发病率、患病率明显增加［11-12］。MS组分与终点事件之间存在剂量反应关系，组分数越多，其心血管疾病危险因素水平越高［13］，本研究结果也表明随着MS包含组分数量增多，冠心病和脑卒中事件的发病率及相对风险呈现增加趋势。因此积极开展MS的防治干预，从降低组分数量的角度开展健康宣教和健康管理对心脑血管疾病及死亡的防治具有重大意义。

2017年底，价值投资行情大盛，这使得某位著名投资人喊出了“茅台是菩萨，它是来给大家送钱的”的疯狂话语。谁知，在2018年1月份之后，市场画风一转，在2月7日沪指的一根大阴K线杀下来之后，市场登时“目瞪口呆”。怎么说好的价值投资呢？说好的冲4000点行情呢？

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝圆鲹（市售）。

2.1.3 温度对Fe2+螯合反应的影响

1.2 仪器与设备

Avanti-25型高速冷冻离心机（美国贝克曼有限公司）；可见分光光度计UV-5200（厦门亿辰科技有限公司）；Five Easv 20型台式酸度测定仪（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；数控计滴自动部份收集器（上海琪特分析仪器有限公司）。

三是在水事违法案件查处、涉水许可等多项工作中宣传《太湖流域管理条例》等水法规，增强政府、部门、流域公众的法律意识，促进了流域各地的宣传活动。两省一市地方普遍开展了行政机关工作人员，特别是领导干部学习《太湖流域管理条例》的活动，很多地方领导干部通过理论中心组、政府常务会议、专题法制讲座培训、自学等多种方式广泛开展学习，在很大程度上增强了依法决策、依法办事的自觉性，流域水利系统干部职工、基层地方政府、广大领导干部依法行政、积极践行《太湖流域管理条例》的观念普遍增强。持续、广泛、创新的宣传与培训取得了明显效果，流域依法治水管水的氛围越来越浓厚。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

清水清洗新鲜原料，沥干后绞碎，分装后置于-18 ℃冰柜冻藏备用。

试验采用蓝圆鲹为原料，利用木瓜蛋白酶将其水解，通过凝胶柱层析收集不同分子量的多肽，并与亚铁离子螯合，研究螯合物对羟基自由基、超氧自由基和DPPH自由基清除活性。

1.3.2 酶解工艺流程

1.3.3 多肽亚铁螯合物合成工艺

原料→解冻→加水混匀→调节pH→加酶→酶解→煮沸灭酶5 min→冷却→离心（4 000 r/min，10 min）→上清液定容→氨基酸态氮测定

酶解液→调节pH→调节温度→加入金属盐→搅拌→加过量95%乙醇溶液→离心（4 000 r/min，20 min）→测螯合率

1.3.4 分析方法

具体的处理时间，1月24日与1月30日至2月2日两个时间段处理的花序，拉长花序的效果不一样，处理后产生的副作用也不一样。处理时间早，花序拉得长。1月24日花序长至7～10 cm （新梢 20～25 cm，5 片真叶完全展开），处理倍数为1∶60 000，花序处理后果穗长度适中，处理后产生的副作用也小。在2月2日处理的，花序处理时间相对晚，处理时采用1月24日的浓度，处理后的果穗比1月24日处理的重，但副作用也比较明显，比如有的果穗上出现不脱落和发育不全的小果粒，花序拉得过长，果穗稀疏松散等。

3.虾苗投放。投放前将筐浸在水中，让虾适应池塘（稻田）水温，可先投放一筐，看虾苗入水后是否正常，然后将虾投放在池塘（稻田）四周，注意不要将虾苗全部投放在一个位置，虾苗活动范围有限。

螯合率测定公式：

1.3.5 抗氧化测定

1.3.5.1 羟自由基（·OH）清除率的测定[15]

在试管中分别加入0.5 mL 10 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、0.5 mL酶解液、0.5 mL 10 mmol/L FeSO4溶液、3.5 mL蒸馏水，加入5 mL 100 mmol/L H2O2启动Fenton反应，摇匀后于510 nm处测定吸光度A1；取0.5 mL蒸馏水代替10 mmol/L FeSO4，测定吸光度A2；取0.5 mL蒸馏水代替酶解液，测定吸光度A3。

2.2.1 化学药剂 化学药剂是控制果蔬采后病害的常见的手段之一，具有经济、杀菌效果好、见效快等特点，因此被广泛应用于果蔬的采后病害的控制。对于杨梅果实采后病害控制的化学药剂的研究有很多，肖艳等[19]采用不同浓度的CaCl2和萘乙酸的混合物处理杨梅果实，发现能够显著提高果实的硬度，减缓软化，并降低采后发病率。水杨酸是一种内源激素，可以降低果蔬采后呼吸作用，延缓组织衰老，并能诱导相关抗病性酶的上升，降低果蔬采后的发病率[20]。

选取pH 6，室温，以时间为单因素进行螯合反应，结果如图2所示。

氨基酸态氮含量测定，按照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》标准执行；酶活力的测定：采用Folin法；游离态铁含量的测定：邻二氮菲法[14]。

将邻苯三酚溶于10 mmol/L HCl溶液配制浓度3 mmol/L的溶液，并用去离子水配制质量浓度分别为10，20，30，40和50 mg/mL的酶解液。取100 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.2）4.5 mL于25 ℃水浴保温20 min，取出后立即加样品5 mL、蒸馏水3 mL及邻苯三酚0.5 mL后迅速摇匀，恒温下每隔30 s测1次A325值，反应4.5 min后结束，得样品V样（即每分钟光吸收的平均变化率），空白管中以10 mmol/L HCl代替邻苯三酚溶液，4.5 min内邻苯三酚自氧化速率为V自。

1.3.5.3 DPPH自由基（DPPH·）清除率的测定[17]

用去离子水配制成质量浓度分别为1，2，3，4和5 mg/mL的酶解液。以95%乙醇溶解DPPH配成浓度10 mmol/L的溶液。取样品液2.0 mL与2.0 mL DPPH·溶液混合摇匀，室温下闭光放置30 min后测定517 nm处的吸光度，记为OD样。空白管以95%乙醇代替样品，测定吸光度，记为OD空。

1.3.6 螯合前后连续紫外波长扫描[18]

将不同分子量范围的多肽与亚铁螯合，在波长范围190～600 nm进行紫外扫描，根据物质吸收峰数目、吸收峰波长及峰值判断是否有新的物质生成。

2 结果与分析

2.1 Fe2+与蓝圆鲹多肽螯合条件的影响因素试验

2.1.1 pH对Fe2+螯合反应的影响

pH条件是影响多肽螯合物形成的重要因素。H+和OH-会与金属离子竞争供电子基团，不利于螯合物的生成。因此在室温，时间10 min，研究pH对螯合反应的影响，结果如图1所示。

结果表明，pH对螯合反应的影响较大，pH 6时，其螯合率最高为95.1%。

2.1.2 时间对Fe2+螯合反应的影响

1.3.5.2 超氧阴离子自由基（O2-·）清除率的测定[16]

随着时间延长，亚铁离子与多肽螯合率变化不大，在10 min时的螯合率最高为95.1%，30 min时的螯合率最低为92.5%，可以推断螯合反应为快速反应，反应时间影响不大，选用最适时间10 min。

图2 时间对Fe2+螯合反应的影响

木瓜蛋白酶（酶活力实测为60×104U/g，广西南宁庞博生物工程有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美国Sigma公司）；牛血清白蛋白（国药集团）；抑肽酶（上海富蔗化工）；葡聚糖凝胶Sephadex G-25（国药集团）；杆菌肽（广东光华化学）；酪氨酸（国药集团）。

选取pH 6，时间10 min，以温度为单因素进行螯合反应，结果如图3所示。

利用Excel 2010软件对数据进行整合后计算每一个被试的D值、D1值、D2值、d’值、d1’值、d2’值；利用SPSS 20.0软件对数据进行信度和效度检验，探讨GNAT内隐测量的信效度；通过描述性统计分析，探究不同实验顺序下GNAT是否存在顺序效应；通过相关样本t检验，探讨内隐自我反应时和内隐他人反应时、内隐自我敏感性和内隐他人敏感性之间的差异；通过独立样本t检验，探讨人口学变量对大学生内隐自杀意念的影响.

在25～45 ℃范围内，螯合率随着温度变化不明显，25 ℃时螯合率最高为95.56%，45 ℃时螯合率最低为93.45%。因此，选择最佳温度25 ℃。

图3 温度对Fe2+螯合反应的影响

2.2 多肽分子量分布

试验利用Sephadex G-25色谱柱分离蓝圆鲹酶解液，分离条件为上样体积3.6 mL，流速1 mL/min，分离结果见图4。

从图4可以看出蓝圆鲹酶解液经Sephadex G-25色谱柱分离后，可分为明显的6个组分。利用牛血清白蛋白、酪氨酸、抑肽酶、杆菌肽为标准品进行洗脱，计算6个组分的分子量，分子量范围见表1。

2.1 一般情况 两组研究对象的一般情况除TG、TC、LDL-C指标相差较大且差异有统计学意义外（P＜0.05），在性别、年龄、BMI等指标方面的差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

图4 多肽洗脱曲线

表1 各组分分子量范围

经计算发现峰6分子量范围过小，可能为杂峰。

2.3 抗氧化活性测定

将分离后的多肽与亚铁离子螯合，按照1.3.5的方法进行自由基清除试验。

由表2可以看出，蓝圆鲹多肽亚铁螯合物具有较强的自由基清除作用。多肽分子量范围在1 570～4 100 Da时，螯合物对羟基自由基（·OH）、超氧自由基（O2-·）清除率最高为50.41%和40.35%；多肽分子量范围在170～1 230 Da时，螯合物对DPPH·清除率最高为55.46%。

表2 多肽亚铁离子螯合物抗氧化活性

2.4 紫外扫描波峰比较

将分子量范围为1 570～4 100 Da和170～1 230 Da的2组多肽螯合前后在190～600 nm处进行连续紫外波长扫描比较，结果如图5（a）和（b）所示。

多肽与亚铁离子螯合，在吸收峰波长和峰值上均有明显变化，说明有新物质生成，发生螯合反应。

检验复合混沌序列的随机性能常用的是NIST测试[17],由确定系统和算法产生的序列,最主要的测试包括其频数测试、游程测试、谱测试和近似熵测试[18]。按照NIST测试的要求,为保证测试结果的可靠性和准确性,每个被测序列的长度应为103～107。因此,选取每个序列长度为106[19]。

图5 多肽及其亚铁离子螯合物紫外吸收光谱

3 结论

蓝圆鲹多肽螯合亚铁离子的最佳螯合条件为：pH 6，温度25 ℃，时间10 min。此时螯合率为95.6%。采用葡聚糖凝胶Sephadex G-25对水解液进行分离，可分离得到5个吸收峰，经计算分子量范围分别为100～115，29～78，5～23，1 570～4 100和170～1 230 Da；抗氧化试验结果表明，蓝圆鲹多肽亚铁螯合物具有较强的清除自由基作用，多肽分子量范围在1 570～4 100 Da时羟自由基和超氧自由基清除率最高分别为50.41%和40.35%，多肽分子量范围在170～1 230 Da的DPPH自由基清除率最高为55.46%；通过紫外连续波长扫描可以看出，吸收峰波长和峰值有明显变化，说明发生螯合反应。