珠兰花组织培养体系建立

孙 玲，沈芷若，万志兵,2，赵昌恒,2*

(1.黄山学院生命与环境科学学院，黄山 245041；2.黄山雾云间生态农业开发有限公司，黄山 245200)

珠兰花(Chloranthusspicatus(Thunb.) Makino)属于金粟兰科，花小，黄色像粟粒，所以又叫金粟兰，主要产于云南、安徽、贵州等地区，其根是富含水分的肉质根，性喜温暖，多年生常绿草本植物，阴性植物，喜散射光，一般生长于较阴湿的林下或沟谷阴坡下缘，忌强光暴晒[1-3]。鲜花极香，制花茶品质优良，是徽州特产，是歙县三大花茶品类之一[4]；花和根状茎可提取芳香油，且研究证明其挥发油的成分具有一定抗真菌活性；珠兰花茶能促进人体新陈代谢，调节内分泌，作为药材用水煎熬，能起到疏理肝郁、活血化瘀、祛除风湿、跌打损伤、消炎的作用，另外，珠兰花对于某些恶性肿瘤有一定的缓解作用[5-12]。因此，珠兰花的推广具有重要意义，但是目前对于珠兰花的研究多有关其药用价值，而对于栽培研究较少，本试验以组培快繁技术培养珠兰花，不仅繁殖系数大，而且操作不受季节限制，可在短期内获得大量植株，可在很大程度上满足生产需要，同时对其种质资源保护和大规模栽培利用提供了新的途径。

在组织培养中，不同培养基与激素处理对外植体的影响不同，王跃华[13]等以MS为基本培养基，采用6-BA与IBA配比处理珠兰花茎段诱导珠兰花丛生芽，以 MS+2.0-3.0 mg/L 6-BA+0.2-0.3 mg/L IBA 组合进行诱导，以 MS+0.5 mg/L IBA配方进行生根诱导，试验结果显示诱导率较高，且组培苗生长良好；凌征柱[14]等在对珠兰花同科植物草珊瑚生根诱导的研究中，以1/2MS+1.0 mg/L IBA 为培养基进行诱导，效果显示较为良好，但上述两者并未对激素配比进行对比选择，实验方案可能具有主观性，科学性较低；黎颖菁[15]等对草珊瑚进行丛生芽与根的诱导，以MS、White、N6和B5为基本培养基，继代培养中附加不同浓度的BA与NAA，结果表明在丛生芽诱导中，MS+2.0 mg/L BA+0.3 mg/L NAA最为适宜，在生根培养中，采用1/2MS为基本培养基，以1/2MS+1.0 mg/L IBA最为适宜；孙占育、王红梅[16-17]等研究表明活性炭在组培苗生根过程中提供黑暗的环境有利于根的生长，同时会吸附植物生长过程中产生的有毒有害物质，可降低污染，防止褐变。

本试验以当年生1.0～1.5cm茎段为材料，以MS为基本培养基，附加不同浓度配比的6-BA和NAA诱导丛生芽；以1/2MS、B5为基本培养基，添加不同浓度的NAA或IBA诱导茎段生根，培养出无菌苗。通过对比珠兰花诱导率、芽数、根数以及组培苗生长状态，选择较适合的诱导丛生芽与生根培养基配方，并于后期将组培苗移栽至温室中栽培，以达到珠兰花可持续利用的目的，为后续繁殖育苗提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

外植体：外植体材料采自天都园林苗圃地和黄山市歙县雾云间珠兰花基地，选取珠兰花当年生幼嫩茎段，并于取样当天进行接种；试验用具：电子天平(感量0.000 1 g)、称量纸、药匙、烧杯、量筒、胶头滴管、容量瓶、棕色及透明广口瓶、移液枪、培养瓶、高压灭菌锅(SQ510C)、封口膜、单人单面净化工作台(SW-CJ-1FD)、剪刀、镊子、脱脂棉、酒精灯、纯水装置等。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒 外植体先在缓速流水下冲洗2 h；在超净工作台内，将外植体以75%酒精浸泡45 s，无菌水冲洗2～3次，再加入0.1%升汞，并加入1～2滴吐温浸泡7 min，用无菌水冲洗 5～7 次(升汞处理重复一次)。

1.2.2 培养基选择 丛生芽诱导培养基：以MS为基本培养基，附加0.6%琼脂、3%蔗糖及0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L的6-BA和0、0.5、1.0、1.5 mg/L的NAA；根诱导培养基：以1/2MS或B5为基本培养基，附加0.2、0.5、1.0 mg/L的IBA或NAA，附加0.6%琼脂、3%蔗糖以及0.2%的活性炭。上面每种培养基每组接种10瓶，重复3次，每瓶接种1个茎段，接种后放入培养室培养。

1.2.3 培养条件 培养室温度为25±2 ℃，湿度为65±2%，光照时间为16 h/d，黑暗时间为8 h/d，培养60 d。

1.3 数据统计与分析

接种后每隔10 d进行一次观察，记录外植体丛生芽与根的数量，以及组培苗生长状况。

芽诱导率/% =诱导出腋芽或不定芽的外植体数÷(接种外植体数-污染的外植体数)×100。

生根率/% =生根的芽苗数÷(接种外植体数-污染的外植体数)×100。

数据统计使用Excel 2010进行，数据处理使用SPSS 20.0软件的ANOVA过程对各处理进行差异性的检验和Duncan法对结果进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同浓度6-BA与NAA配比对珠兰花丛生芽增殖的影响

珠兰花组培苗经过不同激素配比的处理，各处理间对丛生芽诱导率和诱导出芽数的差异见表1。试验结果表明，I10组丛生芽诱导率最大，为71.7%，I3组诱导率最小，为10.4%，且两者有显著差异；对于丛生芽个数来说，处理I10数量最大，为5.8，I7组最小，为1.2个。

注：表中同列数据后无相同字母表示处理间在0.05水平上差异显著。

当6-BA浓度为0.5 mg/L时，丛生芽个数在四组处理之间并没有明显差异，诱导率中，除I1处理外，I2、I3、I4并无明显差异，但四组处理诱导率较其他处理来说较低；当6-BA浓度为1.0 mg/L时，诱导芽数在四组处理之间差异不明显，I5与I6组诱导率差异不显著，I7与I8组差异不显著，四组处理诱导率最高为处理I6，为42.5%；当6-BA为2.0 mg/L时，I10组诱导芽数最多，为5.8个，且显著高于其他三组处理，诱导率同样是I10组最高，与I9组差异不明显，但显著高于I11与I12组；当6-BA浓度为3.0 mg/L时，四组处理在芽数上无明显差异，但在诱导率上，I13与I14组无差异，但显著高于I15与I16组，I13组诱导效果最好，诱导率为57.1%，芽数为3.4个，但也显著低于I10。

组培苗在只有6-BA，即NAA浓度为0时，丛生芽诱导率与芽数均较高，且总体趋势为6-BA在高浓度(2.0或3.0 mg/L)、NAA在较低浓度(0.5或1.0 mg/L)诱导丛生芽效果好， 但当6-BA浓度为3.0 mg/L时，植株生长状况不良，叶色黄绿。当6-BA浓度为1.0、2.0 mg/L时，均是当NAA浓度为0.5 mg/L时，珠兰花诱导丛生芽效果最好；当NAA浓度相同时，诱导珠兰花产生丛生芽的效果为随着6-BA浓度的增加(0.5、1.0、2.0及3.0 mg/L)，总体呈先上升再下降的趋势，当6-BA浓度为2.0 mg/L，丛生芽的诱导率均最大，且显著高于其他相同NAA浓度处理。

图1 珠兰花丛生芽增殖苗

结合诱导率与丛生芽数，I10(MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L)为诱导丛生芽最适培养基。珠兰花丛生芽增殖苗见图1。

2.2 不同培养基对珠兰花组培苗生根的影响

珠兰花茎段经过不同培养基及激素处理诱导生根，各处理间诱导率与平均生根数的影响见表2。试验结果表明，J8组生根诱导率最大，为75.0%，且显著高于其他各组处理，根数也是多组处理中诱导数量最多，为5.6根，除与I9组根数间无显著差异外，显著高于其他组；J1组在诱导率与根数上均为最小值，为34.2%、1.8根。

注：表中同列数据后无相同字母表示处理间在0.05水平上差异显著。

当基本培养基为B5培养基时，在诱导率与根数上六组处理间(J1～J6组)均无明显差异，且在IBA或NAA相同浓度时，均是当基本培养基为1/2MS时数值最大，诱导效果最好；当基本培养基为1/2MS培养基时，J8组处理效果最好，除J11组根的诱导率为66.7%，与J8组无明显差异外，J8组明显高于其他组(J7、J9、J10与J12组)，除与J9组在诱导根数上无显著差异外，与其余四组均差异明显。

当基本培养基与激素相同时，诱导率与根数均表现为先上升后下降的趋势，即当激素浓度为0.5 mg/L时诱导效果最好；从诱导率来看，除J1与J4为J4>J1外，其余为J2>J5、J3>J6、J7>J10、J8 >J11、J9>J12，均表现为在基本培养基与激素浓度相同时，在诱导率上，IBA诱导效果较NAA诱导效果良好。

结合根的诱导率与根数，珠兰花根的诱导培养基以1/2MS+IBA0.5 mg/L为最适培养基。珠兰花生根组培苗见图2。

2.3 组培苗移栽

在组培苗高度达到2 cm以上时进行移栽，先将幼苗移栽至营养土中，于温室中进行培养，并喷施营养液保证幼苗健康生长(营养液配方见表3)，后期移至室外，珠兰花组培苗幼苗移栽见图3。

表3 日本园艺均衡营养液配方

3 结论与讨论

激素在植物生长过程中具有极大的调控作用，在植物组织培养过程中，添加不同激素实际上是重新调整了植物内源生长物质的平衡，外植体组织中内源激素水平的不同引起培养基中最适激素配比的变化。不同植物对培养基以及外源激素及其浓度需求不同。关于珠兰花组织培养及再生体系已有报道，王跃华、黎颖菁等[13-15]对金粟兰科植物做了相关研究，但并未对比不同浓度或不同激素对于诱导丛生芽或生根的影响。

在本次诱导丛生芽的试验中，发现6-BA与NAA配比时诱导率较高，且高浓度6-BA(2.0 mg/L、3.0 mg/L)诱导率高于低浓度(0.5 mg/L、1.0 mg/L)，但组培苗生长状况在6-BA浓度为3.0 mg/L时，长势一般，叶片黄绿；丛生芽诱导率及组培苗生长状况随着NAA浓度的增加总体上呈现先增加后降低的趋势，当NAA浓度为0.5 mg/L时，诱导率最高，即 6-BA与NAA配比为2.0 mg/L与0.5 mg/L为珠兰花丛生芽诱导最适激素配比，诱导率为71.7%，平均诱导芽数为5.8个，达到了显著水平。

图3 珠兰花组培苗幼苗移栽

在诱导珠兰花生根培养中，以B5及1/2MS作为基本培养基，1/2MS培养基诱导效果显著优于B5培养基；选取三组激素浓度(0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L)诱导茎段生根，结果显示，随着激素浓度的增加，总体上生根率及根数先增加后下降，即当浓度为0.5 mg/L时诱导生根效果最好，而IBA诱导效果最优，诱导率达到75%，根数5.6根，方差分析均达到了显著水平。

珠兰花组培苗根系较纤细，移栽时容易折断，且珠兰花植株生长缓慢，在移栽后喷洒一定量的营养液能使幼苗健壮生长，获得更多的健康植株，为珠兰花后续繁殖与应用提供充足的原材料。