地锦草有效成分的提取及其生物活性的研究

许慧瑶， 薛建云， 卢玉栋， 郑文贺

（1. 福建师范大学 化学与材料学院，福建省先进材料化工基础重点实验室，福建 福州350117；2. 福建中医药大学附属人民医院，福建 福州350004）

地锦草（Euphorbiae humifusa）为双子叶植物纲大戟目大戟科大戟属地锦草科[1]，又有铺地草、血见愁、乳汁草、地瓣草等40多个别名[2]，是一种疗效显著的中草药，也是维吾尔族药材和蒙药材。地锦草生命力旺盛，在路边庭院间随处可见，除广东、广西外，分布遍及全国各地，来源广泛，资源丰富[3]。地锦草主要含槲角素甙类、山奈素甙类以及其他黄酮类化合物[4]，具有凉血止血、清热止痢、通乳汁、清热解毒、利湿退黄等功效，药理研究证实黄酮类化合物是地锦草抗菌、止血、抗氧化的主要有效成分，地锦草煎剂、醇提取液及地锦草素均有抗菌止血[5]的作用。地锦草在临床中得到很大程度的应用，多用于治疗痢疾、外伤出血、乳汁不足、肠炎、咳血、便血、崩漏[6]等病症。还可以将地锦草运用到功能性食品、化妆品和制药行业[7]。

黄酮类化合物具有很强的抗氧化性、抗菌、抗病毒能力，可以清除体内过剩的自由基，起到保护机体的作用，具有很好的免疫调节作用，而且对多种酶均有抑制作用[8]。

提取黄酮类化合物方法有溶剂法，比较常用的溶剂一般有水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿等[9-10]，提取方法有超声辅助提法、生物酶方法、超临界流体萃取法等[11-13]。

本文主要对地锦草的黄酮类化合物进行提取，并考察其抗氧化、抗菌、酶抑制等性能，为地锦草的应用提供前期研究。

1 实验

1.1 仪器与试剂

VIS-721可见光分光光度计（上海佑科仪器仪表），CARY 50紫外可见光度计（Varian公司），RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），500 mL索氏提取器（临沂正衡化玻仪器有限公司），细（霉）菌培养箱（福州科远贸易有限公司），无菌操作台（苏州净化设备有限公司）。

地锦草（安徽省亳州市润邦食品有限公司），芦丁、无水乙醇、无水甲醇、氢氧化钠、抗坏血酸、双氧水、碘、碘化钾、可溶性淀粉、六水合硫酸亚铁（国药集团化学试剂有限公司，AR），亚硝酸钠（天津市瑞金特化学品有限公司，AR），硝酸铝（天津市红岩化学试剂厂，AR），水杨酸（上海实验试剂有限公司，AR），磷酸氢二钠十二水合物、磷酸二氢钠二水合物（上海展云化工有限公司，AR），α-淀粉酶（江苏锐阳生物科技有限公司，AR），大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、青霉、曲霉（由福建师范大学生科院提供），所用水均为去离子水。

1.2 地锦草提取工艺

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制[14]

准去称取2.5 mg芦丁标准品，用50%甲醇定容至10 mL，得到浓度为250 μg/mL的芦丁标准溶液。然后分别取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的芦丁标准溶液于25 mL的容量瓶中，加入5%的亚硝酸钠1 mL，摇匀，放置6 min；加10%硝酸铝1 mL，摇匀，放置6 min；再加4%氢氧化钠10 mL，加水定容至刻度，摇匀，放置10 min。在紫外可见分光光度计上于其最佳吸收波长510 nm处测其吸光度，并以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制浓度-吸光度标准曲线。

地锦草提取物中总黄酮含量的计算公式如式（1）所示。

式中：Fc是地锦草中总黄酮含量，mg/g；c是样品吸光度代入标准曲线计算所得浓度，ug/mL；V是溶液试样所需溶剂体积，mL；V1是吸取试样溶液的体积，mL；V2是稀释试样溶液体积，mL；m-地锦草的质量，g。

1.2.2 乙醇浓度对地锦草有效成分提取的影响

称取地锦草10 g，分别加入20倍量75%、80%、85%、90%的乙醇溶液，90℃的水浴下，用索氏提取器回流提取3次，用旋转蒸发仪将提取液进行浓缩，并计算浓缩液总黄酮的含量，最后烘干称重。

1.2.3 料液比对地锦草有效成分提取的影响

称取地锦草10 g，分别加入15、20、25倍量的90%的乙醇溶液，90℃的水浴下，用索氏提取器回流提取3次，用旋转蒸发仪将提取液进行浓缩，并分别计算浓缩液总黄酮的含量，最后烘干称重。

1.2.4 提取次数对地锦草有效成分提取的影响

称取地锦草10 g，加入20倍量90%的乙醇溶液，90℃的水浴下，用索氏提取器分别回流提取1、2、3次，用旋转蒸发仪提取液进行浓缩，并分别计算浓缩液总黄酮的含量，最后烘干称重。

1.3 抗氧化性能的测定[15-16]

1.3.1 空白组

向25 mL容量瓶依次加入2 mL浓度为0.2 mmol/L六水合硫酸铁溶液，1.5 mL浓度为0.2 mmol/L水杨酸溶液，最后加入0.2 mL 体积分数为0.3%的双氧水，用水定容到25 mL，摇匀，用721可见光分光光度计在波长510 nm下测定吸光值A0，平行测定3组，取其平均值。

1.3.2 样品组

取5个25 mL容量瓶，向每个容量瓶中加入2 mL浓度为0.2 mmol/L六水合硫酸铁溶液，1.5 mL浓度为0.2 mmol/L水杨酸溶液，0.2 mL体积分数为 0.3%的双氧水，反应5 min后，向容量瓶中依次加入0.04 g/L的地锦草提取物1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，用水定容到25 mL，摇匀，反应5 min，用721可见光分光光度计在波长510 nm下测定吸光值AX，平行测定3组取其平均值。

1.3.3 对照组

用0.2 mL的蒸馏水替代双氧水，用721可见光分光光度计在波长510 nm下测定吸光值AX0，平行测定3组，取其平均值。

地锦草提取物对羟自由基的清除率按式（2）计算。

式中：A0是空白组样品的吸光值，AX是样品的吸光值，AX0是对照组样品的吸光值。

1.4 地锦草提取物抗菌实验[17]

采用纸片琼脂扩散法对地锦草提取物抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、青霉、曲霉进行试验，每种菌实验重复3次，抑菌效果取3次实验平均值。

1.5 地锦草提取物对α-淀粉酶活性的抑制试验[18]

1.5.1 地锦草提取物的浓度对α-淀粉酶活性的影响

取20 μL α-淀粉酶（由pH 6.8的磷酸缓冲溶液配制），加入20 μL不同浓度的地锦草提取物，于37℃的酶标仪中振荡数下，并恒温10 min后，加入0.4 g/L 140 μL淀粉溶液（称取0.4 g淀粉溶于pH 6.8磷酸缓冲溶液中并煮沸，冷却后定容至100 mL容量瓶，使用时稀释10倍），在酶标仪中振荡数下，且反应2 min后，迅速滴加30 μL 0.01%碘液[19]，振荡，在波长为660 nm下测定波长A0。平行测定三组，取其平均值，若实验数据波动比较大，则在舍去原有数据的基础上进行补测，直至数据趋于比较稳定为止。设置空白组，用等体积pH6.8磷酸盐缓冲溶液代替地锦草提取物，于660 nm测定波长A，地锦草对α-淀粉酶的抑制率按式（3）计算。

式中：A0是样品在660 nm激发波长下测定的样品波长，A是空白样品在660 nm激发波长下测定的样品波长。

1.5.2 地锦草提取物的温度对α-淀粉酶活性的影响

将25 mL浓度为0.001 6 g/mL的地锦草提取物分别置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的恒温水浴中，保温30 min。冷却至室温后，按“1.5.1”的步骤测定对α-淀粉酶活性，并计算其抑制率。

1.5.3 地锦草提取物的pH值对α-淀粉酶活性的影响

分别用pH值为 4.5、5.7、6.8、7.5的缓冲溶液配制相同浓度的地锦草提取物后，按“1.5.1”的步骤测定对α-淀粉酶活性，并计算其抑制率。

2 结果与讨论

2.1 地锦草提取工艺

2.1.1 芦丁标准工作曲线

以芦丁标准品的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标来绘制标准曲线，并对曲线进行拟合得到的线性回归方程为：Y＝0.005 83 X＋0.042 5，其中R2＝0.998 7，这说明在芦丁在0～50 μg/mL具有良好的线性关系，符合定量所需，其工作曲线如图1所示。

图1 芦丁标准品的工作曲线

图2 乙醇浓度对地锦草提取效果的影响

2.1.2 乙醇浓度对地锦草提取效果的影响

采用不同浓度的乙醇溶液对地锦草进行提取，地锦草提取物中总黄酮含量与乙醇浓度的关系如图2所示。由图2可知，当乙醇浓度在75%～85%之间，总黄酮含量是随着浓度的增大而升高，在浓度为85%之后，随浓度的增大而下降。这是由于随着乙醇浓度的增加，溶液中的总黄酮含量也随之升高，然而当浓度过大时，溶液极性变小，会使得地锦草中的其他成分也随之进入到溶液中，所以总黄酮含量变小。因此在一定浓度范围内，乙醇浓度的增加与地锦草中总黄酮含量呈现正相关的计量关系。本实验测得的地锦草提取的最佳提纯浓度为85%。

2.1.3 提取次数对地锦草提取效果的影响

对地锦草进行不同次数的提取，考察地锦草提取物中总黄酮含量与提取次数的关系，结果如表1所示。

由表1可知，随着提取次数的增加，溶液中总黄酮含量也随之增加。从1次增加到2次的总黄酮含量增长的趋势明显大于从2次增加到3次。这是由于随着提取次数的增加，地锦草中的黄酮逐渐进入乙醇溶液中，提取次数越多，进入溶液中的黄酮便越多，但是随着回流次数的增加，能耗、时间都逐步增加，综合考虑之下回流提取3次最佳。

表1 提取次在数对地锦草提取效果的影响

2.1.4 料液比对地锦草提取效果的影响

采用体积分数为85%的乙醇对地锦草进行提取，考察料液比对地锦中黄酮提取的影响，其结果如图3。

由图3可知，随着料液比得到增加，溶液中总黄酮含量随之呈现下降趋势。这是由于在其他条件都不变的情况下，随着料液比的增加，只是增加了溶剂的量，但是地锦草中总黄酮的含量是固定的，提取必定存在极限，继续增大料液比反而使得浓缩过程不能够彻底进行。从图3可以看出，在料液比为1∶15时，溶液中总黄酮含量最高，因此本实验测得的最佳料液比为1∶15。

图3 料液比对地锦草中黄酮提取的影响

图4 地锦草提取物浓度对羟自由基清除效果的影响

2.2 地锦草提取物浓度对羟自由基清除效果的影响

采用不同浓度的地锦草提取物对羟自由基进行清除实验，地锦草提取物浓度对羟自由基的清除关系如图4所示。

由图4可知，随着地锦草提取物浓度的增加，对羟自由基清除率的也随之增大，当浓度达到8.0 mg/mL时，其清除率达到82.04%。说明浓度越大，对羟自由基的清除效果越好，这是由于相同数量的羟自由基，浓度大的提取物对其清除速度快，清除效率高。

2.3 地锦草抗菌性能的测定

为了考察地锦草提取物的抗菌性能，采用纸片琼脂扩散法进行抗菌实验，实验结果如表2所示。

表2 地锦草提取物抗菌性能

由表2可知地锦草对青霉、曲霉均有抑菌效果，且青霉的抑菌圈达到19.52 mm，曲霉的抑菌圈达到18 .29 mm，但是对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抗菌效果几乎为0，并没有明显的抑菌圈出现。

2.4 地锦草提取物对α-淀粉酶抑制作用

2.4.1 地锦草提取物浓度对α-淀粉酶活性的影响

参照“1.5.1”的实验方法来探究地锦草提取物的浓度对α-淀粉酶活性的影响，其结果如图5所示。

由图5可知，随着地锦草提取物浓度的增大，对α-淀粉酶的抑制率先随着增大，当达到一定数值后，随着地锦草提取物浓度的增大而减小。当地锦草提取物浓度在1.6～4.8 mg/L之间，抑制率随着浓度的增大而升高，当浓度超过4.8 mg/L之后，随浓度的增大而下降。因此，4.8 mg/L为抑制作用最强的浓度。在一定浓度范围内，随着地锦草提取物的增加，其对α-淀粉酶的抑制作用呈现正相关的计量关系。

图5 不同浓度地锦草提取物对α-淀粉酶的抑制率

图6 不同温度的地锦草提取物对α-淀粉酶的抑制率

2.4.2 地锦草提取物的温度对α-淀粉酶活性的影响

通过单因素实验来探究不同温度下的地锦草提取物对α-淀粉酶活性的影响，其结果如图6所示。

由图6可知，随着温度的升高，地锦草提取物对α-淀粉酶活性抑制率基本上处于先上升后下降的趋势。在70℃时，地锦草提取物对α-淀粉酶活性抑制率最高，达到了50%左右。

2.4.3 地锦草提取物的pH值对α-淀粉酶活性的影响

为了探究不同pH值的地锦草提取物对α-淀粉酶活性的影响，通过控制单一变量，采用不同pH值的地锦草提取物实验，得到如表3的实验数据。由表3可知，随着pH的增加，抑制率先增加，当达到一定数值后，随着pH的增大呈现下降的趋势。而在pH 6.8时抑制率最大，这符合人体内的正常pH耐受值。

表3 不同pH的地锦草提取物对α-淀粉酶的抑制率

3 结论

通过单因素实验得出地锦草总黄酮的最佳提取工艺为：提取温度为90℃，乙醇体积分数为85%，料液比为1∶15，提取次数为3次。

地锦草提取物对羟基自由基具有一定的清除能力，且在浓度为8 mg/mL是清除率达到最大，为82.04%。地锦草提取物对青霉和曲霉具有一定的抗菌能力，抗菌效果比较显著，抑菌圈达到19.52 mm、18.29 mm，而对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌没有明显的抗菌效果。

地锦草提取物对α-淀粉酶具有一定的抑制作用，最佳抑制条件为：浓度为4.8 mg/mL，pH值为6.8，温度为70℃，此时地锦草提取物对α-淀粉酶活性的抑制率达45.13%。