髓系KLF5基因缺失小鼠腹主动脉瘤形成的生物信息学分析

常全，张娜娜，马冬

腹主动脉瘤（AAA）是一种老年常见高死亡率的心血管系统疾病，目前临床上仍无有效治疗药物，发病机制仍不明确[1]。本课题组前期研究发现，KLF5基因在人和小鼠AAA组织中表达升高，并且小鼠髓系特异性敲除KLF5基因能够下调Myo9b表达，减少巨噬细胞的浸润并抑制小鼠AAA的形成，但是对于详细的KLF5基因调控炎症相关基因表达的网络分析仍需探讨[2]。因此，为了进一步验证髓系KLF5基因表达在炎症和AAA形成过程中的促炎作用，本实验系统分析了CaPO4诱导髓系KLF5基因表达缺失（LyKLF5-/-）小鼠和野生型（WT）小鼠AAA组织的mRNA表达谱，利用在线生物信息学网站对血管炎症及AAA形成相关的基因进行功能和网络分析，为寻找有效药物治疗AAA疾病提供新的分子靶点和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性的C57BL/6小鼠，SPF级，由河北医科大学实验动物中心提供。将其中KLF5-flox小鼠和LysM-cre小鼠杂交培育雄性髓系遗传性LyKLF5-/-小鼠3只，并与同笼WT C57BL/6小鼠3只，AAA模型构建后共同培养14 d。LyKLF5-/-小鼠和WT 6～8周龄雄性小鼠（Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME）均由本实验室繁殖提供。

1.2 研究时间 2015年1月—2016年1月进行小鼠培养及mRNA芯片筛查。2019年2—4月对差异基因进行生物信息学分析。

1.3 CaPO4诱导小鼠AAA模型[3]将LyKLF5-/-小鼠和WT小鼠进行持续麻醉，无菌条件下进行腹部手术，暴露腹主动脉血管，分离肾动脉分支至髂总动脉血管，先包裹浸有CaCl2的无纺布条，后换为浸有磷酸缓冲盐溶液（PBS）的无纺布条。取出棉条后用0.9%氯化钠溶液冲洗，缝合内膜，撒上青霉素粉末，再缝合腹部外膜。

造模成功标准：造模后腹主动脉最大直径（d2）/瘤旁血管直径（d1）≥2。所有小鼠造模成功，实验过程没有死亡。

本研究创新点：

（1）应用生物信息学发现髓系KLF5基因表达缺失小鼠抑制腹主动脉瘤（AAA）形成的炎症网络调控机制。（2）发现主要基因Bcas3、Hck表达上调和Retnla、Olig1、Tnfrsf11a表达下调参与炎症调控，为靶向治疗AAA提供新的分子靶点。

本研究不足：

本研究未进行临床研究，可能存在基因表达之间的相互影响，导致研究结果并不准确。

1.4 腹主动脉组织总RNA的提取及mRNA表达谱的检测 分离小鼠损伤腹主动脉，剪碎血管，置于RNA-Solv的匀浆套管中匀浆（冰盒中操作）。室温静置2～3 min。在匀浆液中加入200 μl的三氯甲烷，12 000 r/min离心15 min（离心半径为8 cm），匀浆液分为3层。吸取上层水相，先后加入无水乙醇、300 μl的RNA洗脱缓冲液Ⅰ、400 μl RNA洗脱缓冲液Ⅰ，10 000 r/min离心30～60 s（离心半径为8 cm），弃去流出液。然后加入500 μl无水乙醇稀释的RNA洗脱缓冲液Ⅱ 2次，分别进行10 000 r/min离心30～60 s（离心半径为8 cm），弃去流出液，洗涤2次。最后加入20 μl焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA，并于-80 ℃保存。确定RNA完整无降解后，用核酸定量仪进行定量，得到RNA浓度，OD260/280在1.8～2.0范围内。基因芯片检测由康成生物有限公司完成。

1.5 差异表达基因的富集分析 将芯片筛查的Fold Change Absolute（|FC|）≥2的全部上调差异基因或下调差异基因输入Metascape在线分析网站，对差异表达基因进行GO功能富集分析和KEGG富集分析，以探究LyKLF5-/-是通过影响哪些功能和分子途径抑制AAA形成的。GO功能富集分析时差异基因的P值设为0.01，KEGG富集分析时P值设为0.03。

1.6 蛋白互作网络构建及分析 分析差异基因编码的蛋白与其他蛋白的相互作用，利用STRING在线数据库进行蛋白互作网络分析，分别得到Bcas3、Hck、Retnla、Olig1、Tnfrsf11a相关基因及其对AAA形成的影响。蛋白互作网络中的节点表示蛋白，线段表示交互作用。

1.7 统计学方法 采用 SPSS 13.0统计学软件进行数据分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因mRNA表达差异分析 mRNA芯片共筛选到上调表达基因646个，下调表达基因1 410个（|FC|≥2，P＜0.05）。mRNA表达谱前50个基因表达差异热图分析结果如图1（彩图见本刊官网电子版）所示，排名前10的上调和下调差异基因的表达倍数见表1～2。组织芯片结果显示：与WT小鼠比较，抑制炎症的基因在LyKLF5-/-小鼠表达增加，Bcas3、Hck基因表达分别上调3.96、3.14倍；促进炎症的基因在LyKLF5-/-组表达降低，Retnla、Olig1、Tnfrsf11a分别下调7.68、5.07、3.66倍。

2.2 GO功能富集分析和KEGG 富集分析 将筛选出的上调差异基因和下调差异基因进行GO功能富集分析和KEGG 富集分析，上调差异基因GO功能富集分析结果显示，在生物学过程中多肽抗原合成和表达的调 控（regulation of antigen processing and presentation of peptide antigen）、核苷二磷酸代谢过程（nucleoside diphosphate metabolic process）、肌节组织的正向调节（positive regulation of sarcomere organization）显著富集（见图2A）；分子功能变化最为明显的是单糖结合（monosaccharide binding）、MAP激酶结合（mitogenactivated protein kinase binding）和转移酶活性（transferase activity）以及转移含氮基团（transferring nitrogenousgroups）（见图2B）；而在细胞成分中溶酶体（lysosome）、核膜（nuclear envelope）和传递质子的v型ATP酶以及V0结构域（V0 domain）富集最为显著（见图2C）。其中增加多肽抗原合成和表达、核苷二磷酸的代谢[4]、MAPK结合[5]可能直接或间接控制炎症的产生；而某些单糖的合成可能抑制炎症[6]，包括自噬溶酶体途径或许是调节炎性反应的关键因素之一[7-9]。

表1 CaPO4诱导LyKLF5-/-和WT小鼠AAA组织mRNA表达谱上调的前10个基因Table 1 Top 10 up-regulated mRNA expression profiles in CaPO4-injured AAA tissues from LyKLF5-/- and WT mice

图1 CaPO4诱导LyKLF5-/-和 WT小鼠AAA组织基因芯片图Figure 1 Gene chip of CaPO4-injured AAA tissues from LyKLF5-/- and WT mice

下调差异基因GO功能富集分析结果显示，在生物学过程中生长发育（developmental growth）、细胞对葡萄糖刺激反应的胰岛素分泌调节（regulation ofinsulin secretion involved in cellular response to glucose stimulus）、平滑肌细胞迁移的正调控（positive regulation of smooth muscle cell migration）显著富集（见图3A）；分子功能变化最为明显的是肌动蛋白结合（actin binding）、细胞外基质结构成分（extracellular matrix structural constituent）和跨膜受体蛋白激酶活性（transmembrane receptor protein kinase activity）（ 见图3B）；而在细胞成分中转移酶复合物（transferase complex）、肌动蛋白细胞骨架（actin cytoskeleton）和受体复合物（receptor complex）富集最为显著（见图3C）。其中平滑肌细胞迁移促进炎症[10]，并且急性炎症及慢性炎症的产生均存在肌动蛋白的调控[11-12]。

表2 CaPO4诱导LyKLF5-/-和WT小鼠AAA组织mRNA表达谱下调的前10个基因Table 2 Top 10 down-regulated mRNA expression profiles in CaPO4-injured AAA tissues from LyKLF5-/- and WT mice

KEGG富集分析结果显示，破骨细胞分化（osteoclast differentiation）、吞噬小体（phagosome）、氨基酸的生物合成（biosynthesis of amino acids）在上调差异基因通路中显著富集；血管平滑肌收缩（vascular smooth muscle contraction），泛素介导的蛋白水解作用（ubiquitin mediated proteolysis）以及肌动蛋白细胞骨架的调控（regulation of actin cytoskeleton）在下调差异基因通路中最为显著（见图4）。其中与炎症相关的通路包括破骨细胞分化[13-14]、血管平滑肌收缩[15]、肌动蛋白骨架[12]等。

图2 上调差异表达基因GO功能富集分析Figure 2 GO analysis for up-regulated gene differential expression

图3 下调差异表达基因GO功能富集分析Figure 3 GO analysis for down-regulated gene differential expression

2.3 蛋白互作网络构建及分析 蛋白互作分析可为分子机制研究提供重要线索。将选取的炎症相关基因输入到STRING在线数据库，选取交互作用评分＞0.7的互作关系，构建髓系KLF5基因缺失影响炎症相关基因的蛋白互作网络。构建结果显示，有5个靶基因蛋白（上调差异基因Bcas3、Hck和下调差异基因Retnla、Olig1、Tnfrsf11a）均与STRING数据库中蛋白匹配，其与其相互作用蛋白的关系如图5所示。

3 讨论

AAA发病机制复杂，血管平滑肌细胞（VSMC）凋亡、氧化应激、炎症、先天免疫、微小RNA（miRNA）、细胞外基质（ECM）和基质金属蛋白酶等多种机制均参与AAA的发生和发展[1]，但AAA形成和发展的具体机制仍难以确定。AAA的发病起源于动脉管壁上的炎症，炎性细胞通过刺激蛋白酶介导ECM和VSMC的降解，导致主动脉管壁的破坏，所以，分析炎症调控AAA的机制尤为重要。目前尚缺少AAA形成过程中的血管炎性因素的生物信息学分析证明。本研究运用基因芯片技术筛选LyKLF5-/-和WT小鼠差异基因，并运用生物信息学方法直观地了解差异基因的富集通路及主要功能，以探讨KLF5在AAA中的调控机制。

图4 差异基因的KEGG 富集分析Figure 4 KEGG analysis for gene differential expression

图5 差异表达基因蛋白与其互作网络图Figure 5 Gene differential expression proteins and their interaction network

本研究发现，GO功能富集分析和KEGG富集分析中上调差异基因富集于有关抑制炎症的通路；下调差异基因富集于有关促进炎症的通路。并且通过蛋白互作网络分析证实，筛选出的Bcas3、Hck、Retnla、Olig1、Tnfrsf11a及其相关蛋白参与炎性反应。其中上调差异基因Bcas3通过促进雌激素分泌的作用抑制炎性反应[16-17]；Hck主要抑制局部炎性淋巴细胞反应[18]，且在前列腺良性病变中高表达而在前列腺癌中低表达；下调差异基因Retnla促进巨噬细胞介导的代谢疾病炎症[19-21]，其相关蛋白促进免疫反应和炎性反应；Olig1使新生大鼠生后早期感染引起的脑损伤加重[22]，其相关蛋白与细胞骨架结构成分相关；已有研究证明KLF5通过上调Tnfrsf11a的表达促进宫颈癌细胞的增殖和侵袭、转移，且Tnfrsf11a相关基因参与免疫反应[23]。赵海光等[24]筛选出人AAA与正常腹主动脉的基因表达谱进行差异表达基因的功能分析，发现差异基因中有与炎性反应和免疫反应密切相关的基因，表明AAA的形成可能与炎症相关。且有报道称一系列不同的炎性细胞（主要包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及肥大细胞）在AAA的瘤壁中表达。本研究结果与以上观点相符，且结果表明筛选出的Bcas3、Hck、Retnla、Olig1、Tnfrsf11a参与炎性反应对AAA的调控。

本研究尚存在一定的局限性，例如本研究利用基因芯片技术和生物信息学技术探讨AAA的发生机制，未进行临床研究，可能存在基因表达之间的相互影响，从而可能导致研究结果并不准确。未来希望针对基因进行进一步研究。

综上所述，髓系LyKLF5-/-小鼠通过对炎症的调控来抑制AAA的产生，筛选出的Bcas3、Hck上调差异基因和Retnla、Olig1、Tnfrsf11a下调差异基因参与炎症的抑制作用。这为AAA的发病机制及靶向药物的研究提供了新思路。

作者贡献：常全、张娜娜、马冬进行文章的构思与设计、数据整理、结果分析与解释，撰写论文；常全、马冬进行研究的实施与可行性分析、数据收集、统计学处理；马冬进行论文修订，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。