荷泽颗粒对脾虚大鼠血清胃泌素、D-木糖浓度、磷酸肌酸激酶的影响*

张 明 吴 晶 彭 真 崔荣华 张菁华 向希雄△

（1.湖北省中医院，湖北 武汉 430061；2.湖北中医药大学，湖北 武汉 430061）

脾虚证是脾系系统常见的证候类型，脾乃先天之本，影响一身正气的盛衰，影响疾病的转归，对小儿的生长发育及免疫力尤为重要。荷泽颗粒是湖北省中医院儿科用于治疗小儿单纯性肥胖的经验方，在临床实践中，发现此方兼具有健脾作用，故本实验采用苦寒泻下、劳倦过度及饥饱失常等复合因素制作脾虚模型，检测荷泽颗粒对脾虚证大鼠的胃泌素（GAS）、D-木糖浓度及CK活性的影响，以期证实此疗效。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性健康Wistar大鼠120只，体质量（180±20）g，购自湖北省实验动物研究中心。动物生产许可证号：SCXK（鄂）2015-0018。使用许可证号：SYXK（鄂）2017-0095。

1.2 试药和仪器 生大黄饮片（湖北天济饮片有限公司）12 kg，入水浸泡30 min，取800 mL浸液煎煮，待水沸腾后，煎煮5 min，过滤、浓缩至浓度为200%的药液。四君子汤：党参、云茯苓、白术、炙甘草，按照质量比3∶3∶3∶2组成（即党参300 g，云茯苓300 g，白术300 g，炙甘草200 g）［1］，浸泡后，常规煎煮2次，用纱布过滤滤液，2次药液混合后，浓缩至浓度为100%的药液。荷泽颗粒：荷叶600 g，泽泻540 g，薏苡仁540 g，苍术540 g，决明子360 g，枳实180 g，山楂360 g，知母180 g。浸泡后，常规煎煮2次，用纱布过滤滤液，2次药液混合后，浓缩至浓度为100%的药液。鼠GAS酶联免疫吸附测定试剂盒（武汉伊莱瑞特生物有限公司，E-ELR0472c）；D-木糖测定试剂盒（南京建成生物研究所）。CK活性由湖北省中医院检验科中康园代为检测，采用生化检测方法。

1.3 分组与造模 实验前适应性观察喂养5 d，然后按随机数字表法分为正常组20只、模型组100只。脾虚大鼠模型制备：采用苦寒泻下、劳倦过度及饮食失节等复合因素复制脾虚模型［2］，除正常组外，模型组灌服生大黄煎剂4 mL/d，每日将大鼠放入水深50 cm水温20℃的水槽中游泳，负重10%，以力竭为度（鼻尖没入水中10 s）。且单日禁食，双日足量自由饮食，造模21 d（造模过程中损耗部分大鼠）。实验第22天起，模型组与正常组中各取5只，经腹主动脉采血，离心后检测两组大鼠的血清GAS、D-木糖浓度、CK活性，进行验模，余大鼠继续实验，由于造模过程中模型组大鼠的损耗，将剩余的70只大鼠，随机分为模型组14只、荷泽低剂量组14只、荷泽中剂量组14只、荷泽高剂量组14只、阳性组14只。

1.4 给药方法 正常组及模型予蒸馏水灌胃3 mL/d，荷泽低、中、高剂量组分别予荷泽颗粒灌胃1.25 mL/d、2.5 mL/d、5 mL/d，阳性组予四君子汤灌胃4 mL/d，共14 d。

1.5 指标检测 分别于干预后的第7、14日各组各取7只大鼠处死。所有大鼠采血前1 h予3%D-木糖溶液灌胃，剂量2 mL/100 g［3］，1 h后，予10%水合氯醛麻醉。采用ELISA检测方法检测GAS、D-木糖浓度；采用生化检测方法检测CK活性。

1.6 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（）表示，组间比较采用方差分析（LSD多重比较）和非参数检验（Kruskal-wallis）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组脾虚证造模情况比较 见表1，图1。造模期间，与正常组比较，模型组大鼠体质量处于不增与下降的趋势。造模7 d，除正常组外，各组均出现眯眼、懒动、扎堆，体质量减轻或不增，大便时干时稀，其间可见脱落的肠黏膜，背毛散乱无光泽，易散落，游泳耐力逐渐下降，此现象一直维持到造模结束。21 d后，与正常组比较，造模各组胃泌素、D-木糖浓度、CK活性均下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 两组各数值比较（±s）

表1 两组各数值比较（±s）

与模型组同期比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

组 别n GAS（pg/mL）D-木糖浓度（mmol/L）CK（IU/L）正常组模型组5 5 61.98±12.45 22.56±1.28△△1.52±0.16 0.55±0.06△3 722.4±79.26 1 403±116.74△△

图1 两组造模期间体质量变化图

2.2 各组干预前后大鼠体质量比较 见表2。各组予相应的药物干预7 d后，各组体质量明显上涨，以荷泽中、高剂量组及阳性组增长更明显，与模型组比较，各组均存在统计学差异（P＜0.05）；14 d后，各用药组体质量增长速度较前回落，与模型组比较，荷泽中、高剂量组及阳性各组差异具有显著性（P＜0.05）。

表2 各组大鼠体质量比较（g，±s）

表2 各组大鼠体质量比较（g，±s）

组 别n 干预前 干预后7 d 干预后14 d模型组荷泽低剂量组荷泽中剂量组荷泽高剂量组阳性组7 7 7 7 7 216.9±3.0 228.6±3.4 229.3±6.5 226.9±3.3 218.5±4.5 251.8±3.0 284.3±4.7△302.6±9.0△297.9±5.2△295.2±6.7△288.5±3.0 312.9±6.3 340.0±7.6△328.6±6.6△350.3±10.7△

2.3 各组大鼠血清GAS、D-木糖浓度比较 见表3。用药7 d后，与模型组比较，阳性组、荷泽中剂量组血清GAS不同程度升高（P＜0.05或P＜0.01）；与正常组比较，各用药组GAS较低，但差异无统计学意义（均P＞0.05）。与模型组比较，阳性组、荷泽中、高剂量组血清D-木糖浓度不同程度升高（P＜0.05或P＜0.01）；与正常组比较，各组D-木糖浓度均较低（P＜0.05或P＜0.01）。用药14 d后，与正常组比较，荷泽中剂量组、阳性组血清GAS、D-木糖浓度升高（均P＜0.05），此时与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠血清GAS、D-木糖浓度比较（±s）

表3 各组大鼠血清GAS、D-木糖浓度比较（±s）

组别正常组模型组荷泽低剂量组荷泽中剂量组荷泽高剂量组阳性组n 7 7 7 7 7 7 GAS（pg/mL）7 d 63.99±4.07**24.37±1.49△△35.58±2.97 50.37±5.48*38.58±6.53 52.90±4.72*14 d 67.61±9.26 46.79±2.90 68.86±5.76 102.97±11.59**△78.74±11.08*100.43±12.50**△D-木糖浓度（mmol/L）7 d 1.90±0.31*0.56±0.07△△0.67±0.93 1.02±0.07*△△0.79±0.28*1.40±0.13*△△14 d 2.17±0.13 1.92±0.14 2.18±0.19 2.63±0.12**△2.48±0.72*2.81±0.10**△

2.4 各组大鼠CK活性的影响剂量与时间效应比较见表4。用药7 d后，与模型组比较，荷泽低、中剂量组、阳性组CK不同程度升高（P＜0.05）；与正常组比较，但差异无统计学意义（均P＞0.05）。至14 d后，模型组与正常比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组大鼠血清CK活性比较（±s）

表4 各组大鼠血清CK活性比较（±s）

组别正常组模型组荷泽低剂量组荷泽中剂量组荷泽高剂量组阳性组n 7 7 7 7 7 7 7 d 2 665.8±381.8△1 595.2±137.8 2 734.8±247.9△2 615.2±323.4△2 115.8±326.4 2 904.0±390.3△14 d 2 780.2±369.0 2 196.6±268.8 2 306.8±356.5 2 587.6±166.1 2 314.4±366.1 2 353.2±88.7

3 讨 论

3.1 脾虚证候的造模方法 《脾胃论》云“大忌苦寒之药伤其脾胃”，本次实验采取了苦寒泻下、饥饱失常及劳倦过度复合因素造模法复制脾虚模。大鼠出现体质量降低、活动减少、便溏、毛发不泽等症，其表现的各种虚弱症状与临床脾虚症状相似，在一定程度上反映了脾虚状态的病理改变，因而该模型有其中医理论依据和实验基础。众多文献推荐采用多因素复合造模方法，其一：单一因素造模，存在造模因素撤除后自然恢复快的问题［4］。因此，本次实验采用复合因素，加大复制脾虚模型的力度，增强模型的稳定性。杨云等用劳倦及饥饱造脾虚模型进行实验研究，表明此法模型复健期较长，较为稳定［5］。其二：对一个证候而言，是有多种致病因素造成的，劳倦过度、饥饱失常法模拟现代人生活饮食不规律、作息不规律，休息时间少，本次实验造模方法贴近临床。临床上脾虚证的病因往往不是单一的，而是多种因素的共同作用结果，故综合因素造模法才更接近临床［6］。根据全国中西医结合虚证老年病防治学术会议制订的中医虚证参考标准及北京师范大学造脾虚证模型标准，制定脾虚动物模型大致的标准是：1）泄泻严重时甚至严重脱肛；2）食少纳呆；3）消瘦，体质量减轻；4）神态萎靡、四肢不收，毛色枯槁；5）蜷缩聚堆；6）易疲劳。第1、2项为主症，第3～6项为兼症，具备两项主症和两项兼症时，即可以认为脾虚证造膜成功［7］。本次实验购120只Wistar大鼠，造模大鼠100只，实验过程中损耗15只，其余造模大鼠均达到上述的脾虚模型标准，其模型成功率达85%；且造模21 d后，与正常组比较，造模各组GAS、D-木糖浓度、CK活性均下降，且存在统计学差异，本次研究的模型不仅在症状上符合脾虚的标准，从客观的指标上，也提示造模组大鼠处于脾虚的状态。

GAS作用于消化系平滑肌上的GAS受体，兴奋与磷脂酶C耦联的G蛋白，产生三磷酸肌醇，激发胃平滑肌细胞的收缩反应，同时也是胃酸分泌的主要调节激素，与组胺、乙酰胆碱共同刺激壁细胞分泌胃酸。实验结果表明脾虚胃肠动力障碍模型大鼠GAS明显降低，用药后GAS可升高。D-木糖是一种五碳糖，通常在血液中并不存在，口服后可在小肠被吸收，故口服D-木糖后在一定时间内血和尿中D-木糖浓度基本上可以反映小肠吸收功能状况。GAS使胃蛋白酶原分泌增多，消化道黏膜修复，因此，血清D-木糖吸收增加，其测得的浓度升高。因此，GAS、D-木糖浓度可以间接反映脾气虚证的严重程度及治疗后的恢复情况。本次研究结果显示，造模21 d后，与正常组相比，模型组GAS、D-木糖浓度明显降低。干预7 d后，与模型组相比，阳性组、荷泽中剂量组血清GAS不同程度升高；与正常组相比，各用药组GAS值较低，但差异不具有显著性。与模型组相比，阳性组、荷泽中剂量组D-木糖浓度均较高，差异具有显著性；与正常组相比，各组D-木糖浓度均较低，差异具有显著性。干预14 d后，荷泽中、高剂量组、阳性组GAS、D-木糖浓度与同期模型组相比，差异具有显著性；与正常组相比，荷泽中剂量组、阳性组组GAS较正常组高，差异具有显著性，而模型组则无显著差异。GAS属于胃肠激素，受中枢调节，在急性恢复期，GAS显著增高，可能与反馈作用相关［10］，它能激发胃平滑肌细胞的收缩反应，增强胃肠蠕动，同时使胃蛋白酶原分泌增多，消化道黏膜修复，与D-木糖浓度具有一定的相关性。CK主要存在于骨骼肌、心肌及脑组织中，在细胞能量代谢中起重要作用，催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之间的可逆反应。CK作用生成的磷酸肌酸含高能磷酸键，是肌肉收缩时能量的直接来源［11］。根据CK的主要生理功能及本次实验研究的结果分析，脾虚模型的CK明显降低，脾虚模型大鼠机体存在能量代谢障碍。在中医基础理论中，“脾主肌肉”的基本理论明确了脾胃功能与肌肉关系密切，脾虚症状可表现为肌肉瘦削，松软无力。本次实验结果显示造模完成后血清CK活性显著降低，干预7 d后，与模型组相比，荷泽低、中剂量组，阳性组CK不同程度增加，且差异具有显著性；与正常组相比，各用药组差异不具有显著性；干预14 d后，模型组和正常组亦无统计学差异。徐琦等从脾气虚模型大鼠血清中测定CK活性，结果发现脾气虚大鼠CK低于正常组，自然恢复组及用药组治疗3周后，两组均恢复正常，与正常组无统计学差异［12］，与本次实验结果一致。

3.2 荷泽颗粒对脾虚大鼠的治疗作用 本方本荷泽颗粒是湖北省中医院儿科多位专家经过多年的经验总结，主要针对于儿童单纯性肥胖中的脾虚湿盛证型，治疗上以健脾利湿为原则。荷泽颗粒前期已进行了本方配合饮食运动疗法治疗儿童单纯性肥胖的临床研究，临床有效率达86.7%［13］。此外，荷泽颗粒还可降低瘦素水平，升高脂联素水平，在肥胖发生发展中起到调节能量代谢的重要作用［14］。全方由荷叶10 g，苍术9 g，泽泻9 g，薏苡仁9 g，山楂 6 g，决明子6 g，炒枳实3 g，知母3 g组成。全方以荷叶、苍术为君药，薏苡仁、泽泻为臣药，生山楂、炒枳实、草决明、知母均为佐助。诸药合参，共奏健脾利湿、理气消食润肠之功。在中医基本理论中，脾失健运，不能正常运化谷物和水液，水反为湿，湿则困脾，进而影响气机的运行，导致气机郁滞，进一步出现精微不布，化为膏脂；反之，脾健，则水湿、膏脂可化［15］。荷泽颗粒既可用于脾虚湿盛型厌食证患儿，也可用于此种证型单纯性肥胖患儿，体现了中医异病同治的原则。本次实验证明，荷泽颗粒中剂量组与四君子汤疗效相当，对脾虚大鼠有可靠的治疗作用。其他剂量组也有不同程度的疗效，但不如中剂量组，低剂量组考虑与药物浓度相关；高剂量组考虑灌胃量大，影响大鼠进食。同时，随着用药时间的延长，胃泌素、D-木糖浓度明显增高，但14d后，模型组与正常组间无统计学差异，说明大鼠具有一定的自我调节，其自愈性强，模型组动物的脾虚症状均有所恢复，模型持续期不长。