慢性阻塞性肺疾病伴认知障碍患者同型半胱氨酸、8-羟基脱氧鸟苷酸、血清淀粉样蛋白A 水平变化及其与认知功能的相关性研究

郭陶陶，王晶晶，袁文杏，刘敏，张向民

慢性阻塞性肺疾病（COPD）主要特征是慢性气流受限且呈进行性发展，主要发病原因为有害气体或颗粒进入肺部而引发的炎性反应［1］。研究表明，COPD 发生于≥40 岁人群，且发病风随年龄增长而升高，≥80岁人群COPD 发病率达28%［2］。COPD 患者不仅易并发心血管疾病、神经元损伤，且高达77%的COPD 患者会出现认知障碍，但具体发生机制目前尚不明确［3］。

同型半胱氨酸（Hcy）是含硫非必需氨基酸，血液中Hcy 因受外界因素影响而升高，易累积并形成高同型半胱酸血症（HHcy）。研究表明，血浆Hcy 水平升高者阿尔茨海默病（AD）发生风险较血浆Hcy 水平未升高者增加1 倍，提示Hcy 在认知障碍发生过程中具有重要作用［4］。8-羟基脱氧鸟苷酸（8-OHdG）是DNA 氧化损伤的重要生物学标志物，COPD 患者血清8-OHdG水平明显升高。氧化应激是引发AD 的重要机制之一［5］。血清淀粉样蛋白A（SAA）是一种急性时相蛋白，正常状态下其水平较低。研究表明，SAA不仅与COPD相关［6］，还可升高白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）等炎性因子水平，进而引发炎性反应，导致神经元丢失、脑白质损伤，并参与AD 的发生发展［7］。笔者推测Hcy、8-OHdG、SAA 可能是COPD 患者出现认知障碍的重要原因。本研究旨在探讨COPD 伴认知障碍患者Hcy、8-OHdG、SAA 水平变化及其与认知功能的相关性，为COPD 患者认知障碍的早期预防和诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017 年1 月—2018 年3 月邯郸市第二医院呼吸内科收治的COPD 患者88 例为COPD组，均符合《2011GOLD 慢性阻塞性肺疾病全球倡议：COPD 诊断、治疗与预防 全球策略》［7］中的COPD 诊断标准，其中男50 例，女38 例；年龄39～84 岁，平均年龄（65.9±13.4）岁，另选取同期本院门诊体检健康者42 例为对照组，其中男23 例，女19 例；年龄40～83 岁，平均年龄（66.1±12.9）岁。对照组与COPD 组受试者性别（χ2=0.011）、年龄（t=3.589）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。根据认知功能将COPD 患者分为认知障碍组（n=57）和非认知障碍组（n=31）。纳入标准：能够完成相关量表测试者；未接受过糖皮质激素治疗者。排除标准：有吸烟史、饮酒史及近期补充过叶酸和/或维生素B12者；合并心、脑、血管疾病及肾功能不全、糖尿病、恶性肿瘤、老年痴呆等者。本研究经邯郸市第二医院医学伦理委员会审核批准，所有患者自愿签署知情同意书。

1.2 认知功能 采用蒙特利尔认知评估量表（MoCA）评价所有受试者认知功能，包括视空间与执行能力、命名、注意力、语言、抽象、延迟回忆及定向力共7 项，满分30 分，≥26 分为认知功能正常，＜26 分为认知障碍。

1.3 Hcy、8-OHdG、SAA 水平 所有受试者于早晨空腹状态下抽取静脉血4 ml，采用酶联免疫吸附试验检测Hcy、8-OHdG、SAA 水平，试剂盒购自宁波瑞源生物科技有限公司。

1.4 Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相对表达量 采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction ，qRT-PCR）检测所有受试者Hcy、8-OHdG、SAA mRNA mRNA 表达情况。应用Trizol 试剂盒提取总RNA，经匀浆、离心、与异丙醇混合、冰乙醇洗涤后采用分光光度法检测波长为260 nm 时的RNA 纯度和浓度，50 ℃ 20 min 反转录合成cDNA。后在qRT-PCR 标准反应系统混合物中加入SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems，CA，USA）进行PCR 扩增，扩增系统为ABI 7500 Fast Real-Time PCR，扩增总体积为20 μl，其中基因引物对0.4 μl、cDNA 1 μl、3 mmol/L MgCl22.4 μl、SYBGreen 10 μl、蒸馏水6.2 μl，共40个热循环。Hcy、8-OHdG、SAA 及β-actin 引物序列和扩增条件见表1，其中β-actin 为内参基因，采用2-ΔΔCT方法计算目的蛋白mRNA 相对表达量，每组实验重复3 次取平均值。

表1 Hcy、8-OHdG、SAA 及β-actin 引物序列和扩增条件Table 1 Primers sequence and amplification conditons of Hcy，8-OHdG，SAA andβ-actin

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以表示，两组间比较采用两独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q 检验；计数资料分析采用χ2检验；Hcy、8-OHdG、SAA 水平及其mRNA 相对表达量与COPD 伴认知障碍患者MoCA 评分，Hcy 水平与COPD伴认知障碍患者8-OHdG、SAA 水平及Hcy mRNA 相对表达量与COPD 伴认知障碍患者8-OHdG、SAA mRNA相对表达量的相关性分析采用Pearson 相关。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MoCA 评分 三组受试者视空间与执行能力、命名、注意力、语言、抽象、延迟回忆、定向力评分及MoCA总分比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；认知障碍组患者视空间与执行能力、命名、注意力、语言、抽象、延迟回忆、定向力评分及MoCA 总分低于非认知障碍组、对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.2 Hcy、8-OHdG、SAA 水 平 三 组 受 试 者Hcy、8-OHdG、SAA 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；认知障碍组患者Hcy、8-OHdG、SAA 水平高于非认知障碍组、对照组，非认知障碍组患者Hcy、SAA 水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

2.3 Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相对表达量 三组受试者Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；认知障碍组患者Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相对表达量高于非认知障碍组、对照组，非认知障碍组患者Hcy、SAA mRNA 相对表达量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表4）。

表3 三组受试者Hcy、8-OHdG、SAA 水平比较Table 3 Comparison of Hcy，8-OHdG and SAA levels in the three groups

表3 三组受试者Hcy、8-OHdG、SAA 水平比较Table 3 Comparison of Hcy，8-OHdG and SAA levels in the three groups

注：与对照组比较，aP＜0.05；与非认知障碍组比较，bP＜0.05

组别 例数 Hcy（mmol/L）8-OHdG（μg/L）SAA（mmol/L）对照组 42 13.25±1.21 11.25±1.58 45.78±15.22非认知障碍组 31 16.22±2.05a 12.25±1.02 75.52±10.84a认知障碍组 57 19.98±1.02ab 19.99±1.21ab 90.32±16.55ab F 值 4.006 4.092 4.297 P 值 0.028 0.026 0.021

表2 三组受试者MoCA 评分比较分）Table 2 Comparison of MoCA score in the three groups

表2 三组受试者MoCA 评分比较分）Table 2 Comparison of MoCA score in the three groups

注：与认知障碍组比较，aP＜0.05

组别 例数 视空间与执行能力 命名 注意力 语言 抽象 延迟回忆 定向力 总分对照组 42 3.85±1.20a 2.96±0.38a 5.93±1.02a 2.94±0.58a 1.99±0.39a 3.54±1.32a 5.99±1.63a 27.36±1.01a非认知障碍组 31 3.64±1.00a 2.68±0.42a 5.83±1.12a 2.96±0.89a 1.77±0.48a 3.25±0.45a 5.91±1.44a 26.15±0.81a认知障碍组 57 1.58±0.82 1.66±0.37 2.76±0.68 1.95±0.38 1.31±0.21 1.66±0.28 4.23±1.12 15.15±0.66 F 值 4.350 3.826 4.522 3.626 3.285 4.565 3.543 3.701 P 值 0.018 0.032 0.016 0.037 0.045 0.015 0.041 0.035

2.4 相关性分析 Pearson 相关性分析结果显示，Hcy、8-OHdG、SAA 水平及其mRNA 相对表达量与COPD 伴认知障碍患者MoCA 评分呈负相关（r 值分别为-0.456、-0.677、-0.413、-0.477、-0.699、-0.478，P＜0.05，见图1、2）；Hcy 水平与COPD 伴认知障碍患者8-OHdG、SAA水平呈正相关（r值分别为0.335、0.442，P＜0.05，见图3），且Hcy mRNA 相对表达量与8-OHdG、SAA mRNA 相对表达量亦呈正相关（r 值分别为0.365、0.441，P＜0.05，见图4）。

表4 三组受试者Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相对表达量比较Table 4 Comparison of relative mRNA expression quantity of Hcy，8-OHdG and SAA in the three groups

表4 三组受试者Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相对表达量比较Table 4 Comparison of relative mRNA expression quantity of Hcy，8-OHdG and SAA in the three groups

注：与对照组比较，aP＜0.05；与非认知障碍组比较，bP＜0.05

组别 例数 Hcy 8-OHdG SAA对照组 42 0.326±0.028 0.316±0.029 0.422±0.030非认知障碍组 31 0.488±0.032a 0.359±0.028 0.715±0.024a认知障碍组 57 0.625±0.031ab 0.587±0.025ab 0.896±0.022ab F 值 3.869 3.701 3.785 P 值 0.031 0.035 0.033

图1 Hcy、8-OHdG、SAA 水平与COPD 伴认知障碍患者MoCA 评分相关性的散点图Figure 1 Scatter plots for correlations of Hcy，8-OHdG and SAA levels with MoCA score in COPD patients accompanied with cognitive disorder

3 讨论

COPD 是一种免疫介导的炎性疾病，常伴发其他多种疾病，如心血管疾病、骨骼功能障碍等，目前已成为影响全球居民身体健康的疾病之一［8］。COPD 可导致视空间与执行能力减弱、注意力急剧下降、语言能力消退、抽象及延迟回忆淡化等认知障碍［3，9］，但目前其具体机制并不明确。研究表明，缺氧及高碳酸血症引发脑内代谢紊乱、神经功能损伤可能是COPD 患者发生认识障碍的重要原因之一［10］。此外，多种分子通路如炎症机制和氧化应激反应及相关因子也被认为是影响认知功能的潜在原因［5，11］。

已有研究表明，HHcy 是脑卒中、认知障碍、AD 等脑功能老化性疾病的危险因素［12］。而Hcy 不仅可通过诱导淀粉样蛋白沉积及Tau 蛋白过磷酸化诱发AD，还可诱导炎症和黏附因子聚集［13］。Hcy 氧化产生的自由基和过氧化氢（H2O2）可导致脑部缺血及缺氧，抑制神经传导，导致认知功能损伤［14］。本研究结果显示，认知障碍组患者Hcy 水平及其mRNA 相对表达量高于对照组、非认知障碍组，非认知障碍组患者Hcy 水平及其mRNA 相对表达量高于对照组；Hcy 水平及其mRNA 相对表达量与COPD伴认知障碍患者MoCA评分呈负相关，表明Hcy 与COPD 患者认知障碍有关，且Hcy 水平越高则患者认知功能损伤越严重。

COPD 患者常出现氧化应激反应，而8-OHdG 不仅是机体氧化应激反应的重要生物学标志物，还是机体代谢和修复能力下降的重要标志。当机体出现氧化应激反应时会产生大量活性氧，后者可通过毒性作用而损伤周围组织活细胞，进而导致DNA损伤、细胞凋亡。研究表明，AD 患者大脑细胞核中8-OHdG 水平明显升高［5］。本研究结果显示，认知障碍组患者8-OHdG 水平及其mRNA相对表达量高于对照组、非认知障碍组，8-OHdG 水平及其mRNA 相对表达量与COPD 伴认知障碍患者MoCA评分呈负相关，提示COPD 伴认知障碍患者8-OHdG 水平较高，且8-OHdG 水平越高患者认知损伤程度越严重。

COPD 患者常表现出全身性炎性反应［15］。IL-6、TNF-α、白介素10（IL-10）等是常见的炎性因子，研究表明，上述炎性因子不仅在COPD 患者器官功能障碍中发挥重要作用，还参与了AD 的发病过程［11］。SAA在大脑中积聚过多可导致机体炎性因子水平升高，进而引发脑细胞炎性反应。研究表明，AD 患者SAA 水平明显升高［7］，提示SAA 可通过调控炎性反应而导致认知障碍。本研究结果显示，认知障碍组患者SAA 水平及其mRNA 相对表达量高于对照组、非认知障碍组，SAA水平及其mRNA 相对表达量与COPD 伴认知障碍患者MoCA 评分呈负相关，与上述研究结果相似。

有研究表明，COPD 患者Hcy 水平升高的同时一些炎性因子如C 反应蛋白（CRP）也会发生活化，提示Hcy可能通过调控炎性反应而参与COPD 发生发展［16］。此外，Hcy 水平升高还可促进机体发生氧化应激反应，导致8-OHdG 水平升高［17］。本研究结果显示，Hcy 水平及其mRNA 相对表达量与COPD 伴认知障碍患者8-OHdG、SAA 水平及其mRNA 均呈正相关，提示8-OHdG、SAA可作为Hcy 下游调控因子在COPD 患者认知障碍中发挥作用，但其具体机制仍有待进一步探讨。

图2 Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相对表达量与COPD 伴认知障碍患者MoCA 评分相关性的散点图Figure 2 Scatter plots for correlations of relative mRNA expression quantity of Hcy，8-OHdG and SAA with MoCA score in COPD patients accompanied with cognitive disorder

图3 Hcy 水平与COPD 伴认知障碍患者8-OHdG、SAA 水平相关性的散点图Figure 3 Scatter plots for correlations of Hcy with 8-OHdG and SAA in COPD patients accompanied with cognitive disorder

图4 Hcy mRNA 相对表达量与COPD 伴认知障碍患者8-OHdG、SAA mRNA 相对表达量相关性的散点图Figure 4 Scatter plots for relative mRNA expression quantity of Hcy with relative mRNA expression quantity of 8-OHdG and SAA in COPD patients accompanied with cognitive disorder

综上所述，COPD 伴认知障碍患者Hcy、8-OHdG、SAA 水平及其mRNA 相对表达量明显升高，且Hcy、8-OHdG、SAA 水平及其mRNA 相对表达量与COPD 伴认知障碍患者认知功能损伤程度呈负相关。

作者贡献：郭陶陶进行文章的构思与设计并撰写论文；王晶晶进行研究的实施与可行性分析；袁文杏进行数据收集、整理；刘敏进行统计学处理、结果分析与解释；张向民进行论文修订；郭陶陶、张向民负责文章的质量控制及审校，并对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。