针刀干预兔膝骨关节炎后血清中TGF-β1和Smads蛋白的差异性表达

杨郁鹏，赵季宇，李佳茹，曹韵茗，闫 婧，郝重耀，金晓飞

（山西中医药大学，山西 晋中030619）

膝关节骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA），是一种常见的膝关节退行性损伤疾病，多发于中老年人群。近些年的发病率呈上升趋势，成为困扰人民生活的重要疾病之一［1］。发病时常伴有膝部的疼痛、肿胀，甚至畸形等症状。大量的临床实践已经表明针刀治疗膝关节骨性关节炎有良好的疗效，但是治病机理尚未完全明确［2］。有研究表明，TGF-β1/Smads信号转导通路与多种软组织损伤性疾病相关，如KOA等。本研究通过针刀疗法治疗KOA后，取血清进行转化生长因子β1（TGF-β1）和Smad蛋白的相应检测，以探究针刀的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 40只6月龄成年清洁日本大耳白兔，雌雄各半，体质量（2.25±0.1）kg，实验动物由北京市昌扬西山养殖场提供，中国食品药品检定研究院检测，许可证号SCXK（京）2016-0007，饲养于山西中医药大学实验中心清洁级动物实验室。温度20℃，湿度50%～55%，单笼饲养，自由饮水摄食。

1.1.2 材料与试剂 一次性无菌针灸针（0.18 mm×25 mm）、一次性毫针刀（0.35 mm×30 mm）：北京中研太和医疗器械有限公司；华佗牌电子针疗仪（SDZ-II）：苏州医疗用品有限公司；树脂石膏绷带：浙江安吉华埠实业有限公司；离心机（HC-3018）：安徽中科中佳科学仪器有限公司；兔TGFβ1酶联免疫分析试剂盒：上海广锐生物科技有限公司；兔磷酸化信号转导分子2（P-SMAD2）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒：上海广锐生物科技有限公司；兔磷酸化信号转导分子3（P-SMAD3）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒：上海广锐生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模 适应性喂养1周后将6月龄日本大耳白兔40只，随机分为空白组、模型组、电针组、针刀组，每组10只。空白组只进行饲养，其余各组采用石膏绷带对兔左后肢伸直位制动。采用左后肢伸直位固定制动法进行模型的建立［3-5］，除空白组外的其余各组制动达25 d以上，建立KOA模型，本课题组实验前期已经验证了实验模型的稳定。造模期间动物膝关节无破损、无化脓症状，动物无死亡，实验数据完整无脱落。

1.2.2 治疗方法 空白组：只进行常规饲养，不进行其他人为的干预措施。模型组：进行造模后常规饲养。电针组：造模成功后1周，取膝部穴位阳陵泉、阴陵泉、内膝眼、外膝眼，行电针疏密波刺激，频率为2/100 Hz，强度为3 mA，20 min/次。隔日治疗，每周3次。针刀组：造模成功1周后，确认模型的稳定，以内侧、外侧副韧带，髌韧带两端连接点以及中点为进针点，常规消毒，针刀刀口线与韧带纤维方向平行，垂直进针后旋转刀体在膝部损伤处扫散松解，出血后按压止血。每周1次，治疗3次。

1.2.3 取材 干预治疗结束后，行腹主动脉取血，取血5 mL，缓慢注入离心管，3000 r/min，离心20 min，取上清液。用ELISA方法检测血清中TGF-β1和p-Smad2以及p-Smad3的含量。

1.3 统计学方法

数据用SPSS 24.0统计软件进行分析。实验数据均以均数±标准差（±s）表示，计量资料用单因素方差分析，组间比较用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗后各组血清中TGF-β1含量的变化

与空白组相比，模型组TGF-β1水平明显下降（P＜0.01）。与模型组相比，电针组和针刀组TGF-β1水平显著上升（P＜0.05）。与电针组相比，针刀组TGF-β1水平显著上升（P＜0.05）。结果见表1。

表1 各组血清中TGF-β1含量比较 （n g/L，±s）

表1 各组血清中TGF-β1含量比较 （n g/L，±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01；与电针组比较，3）P＜0.05

组别 n TGF-β1空白组 10 183.93±8.15模型组 10 169.05±16.841）电针组 10 175.93±6.29针刀组 10 188.20±4.742）3）F值 7.021 P值 0.001

2.2 治疗后各组血清中p-Smad2和p-Smad3含量的变化

与空白组相比，模型组p-Smad2和p-Smad3表达显著上升（P＜0.01）。与模型组比较，电针和针刀组p-Smad2和p-Smad3表达水平显著下降（P＜0.01）。与电针组相比，针刀组p-Smad2和p-Smad3表达水平显著下降（P＜0.01）。结果见表2。

表2 各组血清中p-Smad2和p-Smad3含量比较 ng/mL，±s（ ）

表2 各组血清中p-Smad2和p-Smad3含量比较 ng/mL，±s（ ）

注：与空白组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01

组别 n空白组 10模型组 10电针组 10针刀组 10 F值P值p-Smad2 p-Smad3 1.86±0.29 1.86±0.28 2.31±0.051） 2.32±0.051）2.21±0.061） 2.20±0.071）2.07±0.131）2） 2.08±0.131）2）13.564 13.226 0.000 0.000

3讨论

膝关节骨性关节炎，中医又称“痹病”“鹤膝风”，作为一种慢性退行性关节病，其疾病的发展可由最初的韧带以及软组织损伤到后来的半月板破裂甚至最后的骨的病变，病情逐渐加重。炎症的范围也会从病变局部发展到全膝继而到最终随血液运行全身。有研究表明，当关节部发生损伤时，炎性的表达会增加，会对产生修复性的因子的表达发生限制与阻碍，导致正常表达的障碍，使得损伤的自我修复进程缓慢，甚至长时间的表达障碍会使得病程迁延持续，进而使得组织分解，生理功能丧失，最终导致不可逆危害［6］。

在人体正常的生理功能中，研究表明有众多信号转导通路的参与，在软骨等组织损伤中TGF-β1/Smads通路的表达参与最为重要。TGF-β1作为一种多功能转化生长因子，在组织的生长、发育、表达过程中广泛参与转化，对肌体产生的损伤进行修复［7］。另外TGF-β1还可以激活带动下游的相关因子表达，使得组织的修复构建完整。Smads蛋白作为TGF-β1/Smads通路的下游蛋白［8］，其表达调控通过上游的TGF-β1刺激得以激活。Smad2、Smad3占据Smads蛋白的重要成分，其能否正常表达，关系着软骨等组织的功能的发挥与否。目前，多数学者认为提高TGF-β1的蛋白的表达含量，可以有效改善膝骨关节炎中破坏的软骨细胞以及细胞基质的合成，进而缓解组织的损伤。杨帆等［9］利用补肾通络方提高KOA兔的TGF-β1的蛋白的表达含量，可以有效抑制软骨细胞的损伤。吴红等［10］发现激活TGF-β1/Smad 2/3途径，可以促进细胞基质成分的合成和分泌，缓解椎间盘的退变。乙军［11］在小鼠关节炎中发现注射PARP-1抑制剂可降低膝骨关节中MMP-13的表达，继而影响Smad2、Smad3的磷酸化水平，使得膝骨关节炎得以缓解。近些年的研究表明，在多种疾病中均可以从血液中检测出相关因子的变化。因此认为当发生KOA时，血液作为一种周身循环的载体，可以准确反映人体局部的病变，关注其中相关指标的变化可能为疾病的检测和治疗提供一种全新的思路。

针刀疗法将传统针刺以及现代外科手术有效结合，在充分发挥针灸作用的同时，避免了外科手术的创伤。作为一种中医现代微创手术，针刀在临床的实践中得到了广泛的认可，尤其是在软组织损伤疾病中充分发挥了其特有的优势，它通过勾割等手法，可以更好地松解组织的粘连，分解局部的结节、骨赘等，进而改变关节的不均匀受力，使得由软组织病变导致的失衡得以恢复正常。本研究采用针刀和针灸对KOA疾病进行干预，发现针刀干预后，动物的膝关节活动明显改善，初次干预后膝部就出现了小范围的屈曲，但针灸尚未出现。行3次针刀干预后，膝部已经可以大范围的伸缩屈曲，且膝部关节的血供情况良好，动物活动自如。针刺治疗3周后膝部也出现了小范围的活动，但效果远不如针刀明显。因此对不同组别动物血液中的TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3的含量进行检测，发现其也出现了明显改变。由此可以推断针刀的作用不仅仅局限于对损伤部位的刺激，还可以通过对损伤处的松解，有效地刺激TGF-β1/Smads信号转导通路，使得血液中TGF-β1含量上升，p-Smad2、p-Smad3的表达下降。由此也可以进一步推断针刀的作用机制可能是在对膝周病变组织松解的同时，也对相关的信号通路的表达进行了调控，继而使得血液中的相关因子也随之发生改变。

本研究通过对针刀作用下部分蛋白因子的表达进行检测，有效证明了针刀的作用可以深入因子甚至分子蛋白水平，但实验检测时因子的数量有限，且只选取了一条信号通路上的因子，尚未可以完全证明针刀的作用机制，有待后期的实验可以在TGF-β1/Smads信号转导通路的基础上进一步深入研究，为针刀治病机制的阐述提供相关的理论以及实验依据。