CHD心气虚证与心肌细胞Ca2+浓度变化的相关性研究

王舒生，马月香

（山东中医药大学中医学院，山东 济南250355）

冠心病（coronary artery heart disease，CHD）是临床上最常见和多发的疾病之一，是指因冠脉血管发生动脉粥样硬化病变，使心血管管腔逐渐狭窄甚至阻塞，增大了血流阻力，引起心肌及其细胞组织的缺血、缺氧甚至坏死，造成心肌的能量代谢障碍，从而导致心功能减退的一种心脏疾病［1］。而能量代谢的实质其实是中医学“气”的功能范畴［2］，可见心功能的减退与“气”的亏虚密切相关，多项现代研究亦表明，心气虚证是CHD的主要证型［3-4］。研究发现，心功能的减退与心肌细胞Ca2+浓度的变化密切相关［5］。然而，当前对于CHD心气虚证与心肌细胞Ca2+浓度变化之间关系的相关报道较少，亦未见严格设计下的相关实验研究［6］。因此，课题组拟通过文献查阅和实验研究的方法来探讨心肌细胞Ca2+浓度的变化与CHD心气虚证发病的相关性，旨在揭示其微观机制，为CHD心气虚证的临床治疗提供理论依据。

1 CHD心气虚证和心肌细胞Ca2+浓度变化的相关性分析

1.1 心肌兴奋收缩藕联功能的异常与心肌细胞Ca2+浓度变化的相关性

现代研究发现，心肌兴奋收缩藕联功能的异常是CHD主要的病理变化之一［7-8］，而Ca2+参与了心肌肌肉收缩-舒张期间的全过程。Ca2+在机体组织的细胞内分布广泛，是机体细胞之内最重要的信使分子之一，机体细胞对其浓度变化异常敏感，这也使得Ca2+浓度的变化会迅速导致机体细胞内信号传导的变化，从而对机体组织造成一定程度的损伤，且这种传导途径的异常在疾病的病理变化中起着至关重要的作用［9］。当Ca2+渗入机体心肌细胞内时，肌浆网（SR）内部的RyR2通道会因为RyR2受体的激活而开放，进而SR会释放出大量的Ca2+［10］。SR是一种细胞内的膜网络，其围绕着收缩结构细胞，不仅可以贮存Ca2+，而且可以在心肌的收缩-舒张期间保持Ca2+浓度的动态平衡［11］。当心肌细胞Ca2+的浓度于短时间内突然升高之时，便会引起心肌肌丝的迅速收缩，使心脏舒张期快速结束，从而过早的进入收缩期。此时，高浓度的Ca2+会被SR上的钙泵（SERCa2）和细胞膜上的钠钙交换体（NCX）迅速清除掉，令心肌收缩机制钝化，从而引发心肌快速舒张，使心脏又迅速地进入舒张期。由此可以看出，Ca2+转运贯穿于心肌兴奋-收缩藕联的整个过程当中。Ca2+浓度的变化常常可以反映出心脏功能的改变，有研究发现，SR上RyR2基因的异常表达会引起机体细胞胞浆内的游离Ca2+浓度失去平衡，进而导致心肌的收缩、舒张功能异常，最终引发心肌兴奋收缩藕联功能的异常［12］。研究发现，胞浆内Ca2+浓度的改变能够明显影响心肌的舒张功能，当其浓度下降时，由于大量的钙离子被转运到了胞浆之外，因而胞浆内剩余的钙离子存储量大量减少，所以释放的钙离子减少，从而降低了心肌的收缩力，相应的，亦降低了心肌舒张力，进而导致心肌兴奋收缩藕联功能的异常［13］。

1.2 心肌损伤与心肌细胞Ca2+浓度变化的相关性

心肌损伤是促发CHD重要的先决条件之一，当心肌受损时，会引起ATP酶活性的降低，而细胞膜上的ATP酶又是维持细胞内环境稳定的基础，可逆电化学梯度进行Ca2+的转运［14-15］。ATP酶活性的降低会引起心肌细胞膜结构的损害，从而使得再灌注期间其生成的氧自由基会引发肌膜脂质的过氧化作用，进而加重心肌细胞膜的损伤，导致心肌细胞膜增加了其对Ca2+的通透性，此时心肌细胞Ca2+内流造成的钙超载又会加重心肌细胞的损伤，甚至凋亡，从而影响心功能的正常发挥，造成心脏能量代谢的异常和负荷的加重，且随着心功能的降低，心肌损伤的程度又会随之逐渐加重，形成心功能降低与心肌损伤相互影响的恶性循环［16-17］。赵强等［18］研究表明，导致慢性心力衰竭心功能降低的重要因素之一是Ca2+通道密度的增加，使胞浆内Ca2+浓度升高，从而造成心肌损伤。Zuzana K等［19］研究表明，心功能降低时，心肌细胞内钙离子的释放量显著降低，从而使心肌收缩力下降，肌浆网钙离子舒张期渗漏增加，导致胞浆内Ca2+浓度升高。以上皆说明了心肌细胞Ca2+浓度的改变与心肌损伤密切相关。临床研究表明，钙拮抗剂（即钙通道阻滞剂）对心血管平滑肌有显著的扩张和松弛作用，能够阻断机体心血管平滑肌上的Ca2+通道，从而抑制细胞外Ca2+的内流，降低细胞内Ca2+的浓度，使心肌耗氧量有效降低，显著改善心肌缺血和坏死的情况［20］。可见心肌细胞Ca2+浓度的升高与心肌损伤密切相关。

1.3 动脉粥样硬化程度与心肌细胞Ca2+浓度变化的相关性

CHD患者的冠状动脉内存在粥样硬化的斑块，当心气虚引起心肌缺血等心功能损伤时，粥样硬化斑块便极易破裂，从而导致内膜受损，随即激活凝血系统，而Ca2+在凝血的全过程中作为凝血因子Ⅳ起到了非常重要的作用。Ca2+在参与此凝血的过程中会有一定的消耗，从而使心血管中血清钙的含量降低，导致“钙反常”现象的发生。血清钙含量降低时，不仅可以增加血管平滑肌的跨膜内流，还可以使增加甲状旁腺激素的分泌，从而使心肌细胞胞浆内Ca2+浓度的升高，造成了血管中血清钙含量降低，胞浆内Ca2+浓度升高的反常现象。当冠脉平滑肌细胞处于其胞浆内Ca2+浓度升高的负荷之下时，不仅会增加其收缩敏感性，甚至会诱使其痉挛，从而促使冠状动脉管壁的粥样脂质沉着，导致加重动脉粥样硬化的程度，进而加重CHD患者的病情［21］。另外，吴瑞杰［22］研究亦表明，CHD患者体内血清钙的含量较正常人低，通过补钙使血钙含量升高能有效降低血管张力，抑制血管平滑肌跨膜内流的增加，从而降低胞浆内Ca2+的浓度，有效控制CHD的病情。由此可知，心肌细胞Ca2+浓度的升高可加重动脉粥样硬化的程度。

综上所述，CHD心气虚证的主要病理变化和影响因素等均与心肌细胞Ca2+浓度的变化密切相关。由此，课题组提出科学假说：“心肌细胞Ca2+浓度的升高既是CHD心气虚证发病的关键因素，又能加速其病情进展”。并据此进行了严格设计下的实验研究，以揭示CHD心气虚证与心肌细胞Ca2+浓度变化的相关性。

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠70只，体质量（200±20）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0001。实验动物饲养于山东中医药大学动物实验室。温度为（21±3）℃，湿度为（50±10）%，每日光照12 h，自由进食、饮水。

2.1.2 益气活血方药的制备 将购自济南市历下区人民医院的中药饮片，以3∶2∶2∶1的比例分别称取人参、丹参、黄芪、川芎饮片，饮片与水的比例为1∶5。步骤：①中药饮片浸泡30 min；②武火加热沸腾后保持其微沸状态转文火慢煎20 min；③滤过药液，药罐中留下药渣，加3.3倍量的水；④重复②的步骤，然后合并两次的滤过药液，静置于室温下待其浓缩；⑤离心取上清液，定容至生药1.8 g/mL，-20℃冻存待用。

2.1.3 实验试剂和仪器 高速低温离心机（型号MICROMAX RF，生产厂家，Thermo IEC美国），超低温冰箱（型号725，生产厂家，Thermo Forma美国），手术包（山东中医药大学附属医院）；左旋硝基精氨酸L-NNA（Sigma公司）；盐酸地尔硫卓（山东中医药大学附属医院），Olympus-Au5800，组织匀浆器，全自动生化分析仪。

2.2 实验方法

2.2.1 造模 大鼠适应性饲养7 d后，先将其随机分为7组（10只/组），其中1组为空白对照组，1组为假手术组（行冠脉穿线术但不进行左冠状动脉结扎术），其余均为手术组。手术组大鼠采用“左冠状动脉结扎术加升压药”法制备冠心病心气虚大鼠模型。麻醉大鼠，在无菌情况下先行气管切开术，再行气管插管术，手术期间以动物呼吸机辅助其呼吸。剔除大鼠胸腹部的毛发，消毒手术区皮肤。随后沿左锁骨中线纵行切开皮肤2 cm，于第四、五肋间打开胸腔，剪开心包，轻压右边胸廓，迅速将心脏挤压出来。在左冠状动脉前降支中上1/3处行动脉结扎术后放回心脏。最后逐层关胸，待大鼠苏醒后拔气管插管。CHD大鼠模型评价标准为：24 h后心电图ST段下移和T波改变。术后每只大鼠肌注青霉素10万U/d以预防感染，并于常规饲养7 d后，手术组大鼠以左旋硝基精氨酸15 mg/（kg·d）两次腹腔注射，持续4周，空白对照组大鼠和假手术组大鼠则以生理盐水（1 mL/d）腹腔注射，持续4周。

去除术中及术后死亡的大鼠，术后将造模成功的大鼠进行常规喂养7 d，手术组大鼠给予左旋硝基精氨酸15 mg/（kg·d），3周内每天分两次腹腔注射，空白对照组大鼠和假手术组大鼠则给予生理盐水（1 mL/d）腹腔注射，持续3周。

2.2.2 分组与给药 称重后，将手术组大鼠按体质量分成随机模型组、益气活血方低剂量组［9 g/（kg·d）］、益气活血方中剂量组［13.5 g/（kg·d）］、益气活血方高剂量组［18 g/（kg·d）］、盐酸地尔硫卓组［0.05 g/（kg·d）］5组，每组8只。各给药组将药物调至相应体积后灌胃给药（空白对照组和假手术组腹腔注射等体积生理盐水），持续2周。于实验第46天麻醉各组大鼠（10%水合氯醛250 mg/kg），待大鼠麻醉后行心脏剥离术，并将剥离出的心脏迅速贮存于液氮中，待实验结束后将其转入-80℃的冰箱中保存待测。

2.2.3 心肌细胞Ca2+浓度测定 全自动生化分析仪测定心肌细胞Ca2+浓度变化：灌胃后46 d于麻醉下开胸，取各组大鼠心脏，洗净后在冠状动脉结扎处切取部分心肌组织块，按1∶9的比例将心肌组织块和生理盐水配制后匀浆、离心、取上清液，随后用全自动生化分析仪测定心肌细胞Ca2+的浓度。

2.3 统计学方法

统计软件选用SPSS 21.0进行数据的处理分析。计量资料以均数±标准差（±s）来表示，并进行单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

与空白对照组比较，模型组大鼠心肌细胞Ca2+浓度升高明显（P＜0.05）。与模型组比较，益气活血方高剂量组大鼠心肌细胞Ca2+浓度降低明显（P＜0.01），益气活血方中剂量组与盐酸地尔硫卓组大鼠心肌细胞Ca2+浓度均有降低，且作用相当（P＜0.05）。结果见表1与图1。

表1 药物干预对各组大鼠心肌细胞Ca2+浓度变化的影响（±s）

表1 药物干预对各组大鼠心肌细胞Ca2+浓度变化的影响（±s）

注：与空白对照组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与模型组比较，3）P＜0.05，4）P＜0.01

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图1 药物干预对各组大鼠Ca2+浓度的影响

4 讨论

CHD的病名虽未载于中医经典古籍之中，但依据其在临床上表现出来的症状与证候特点等因素，现代研究多将其归属于“胸痹”“真心痛”等范畴［23］，且古代医家对其论述颇丰，如《灵枢·五邪》中说：“邪在心，则病心痛”，《素问·举痛论》中说：“心痹者，脉不通”，认为心气虚无力推动血运，血流不畅而致瘀，不通则痛，是CHD的主要病因，故为心痹之病。《金匮要略·胸痹心痛短气病脉证治》中强调“阳微阴弦，即胸痹而痛，所以然者，责其极虚也”，上焦心阳之气不足，阴血瘀滞而现弦象，因而胸痹心痛的脉象表现为“阳微阴弦”。

相关研究表明，心气虚是CHD的主要证型和病理因素，气虚血瘀所导致的心脉“不荣则痛”与“不通则痛”是CHD发病的病理基础［24-25］。因此，益气活血、化瘀通络是CHD的基本治则。

本研究所采用的益气活血方是全国著名名老中医张珍玉教授经60余年临床经验总结所得的经验方，其基本方的组成为人参、黄芪、川芎、丹参。方中以人参为君，大补元气之余，亦能充养心气，培养脾气，从而发挥复脉固脱之效。黄芪为臣，补中益气、固摄血液。二药相合，既可充养心、脾二经之气，又寓气旺血畅之意。川芎、丹参共为佐使之药，川芎行气活血、开散郁结；丹参通经活血、祛瘀止痛，二药既可共助气运以行血，又可共化瘀血以消滞。四药相合为用，组方精炼，经临证加减，在临床上取得了良好的疗效。所以，通过益气活血方“以方测证”“以方治证”来探寻CHD心气虚证与心肌细胞钙离子浓度变化的相关性，及其对CHD临床治疗的指导作用，必然是有效的途径之一。

本研究结果显示，模型组大鼠心肌细胞Ca2+浓度较空白对照组明显升高，与模型组比较，各治疗组大鼠心肌细胞内的Ca2+浓度皆发生了改变，益气活血方高、中剂量组与盐酸地尔硫卓组大鼠心肌细胞Ca2+浓度均明显降低，其中益气活血方高剂量组Ca2+浓度的降低最为显著。

从中医学的角度来分析，心属火，主血脉，《易经》离卦（）与心藏象相应［26-27］。离卦之象为一阴爻藏于二阳爻之内，阴敛于阳，阳护于阴，正如心阳顾护心阴，心气调控心血，可见心阳之气是推动血运的基本动力，而充沛的心气则是心脏搏动正常的基础，心气充足方能使血液在脉中循流不息，不滞于脉管，不溢于脉外。而心肌兴奋收缩藕联工作过程的本质其实就是心气推动心血注于脉中时所产生动能的过程。前期研究提到能量代谢属于“气”功能的范畴，当心气亏虚之时，心脏能量代谢的过程亦必受影响，即能量代谢的动能不足，这种动能不足会使心脏贮存、产生及释放能量的各个环节发生障碍，从而导致其收缩或舒张功能受到损害，最终导致心肌兴奋收缩藕联功能的异常［28］。

中医学认为“气为血之帅”“气行则血行，气滞则血瘀”。若心气亏虚，无力推动血行，可致血流不畅，血运迟缓，日久则血行滞涩，脉道失于通利，血脉瘀阻不通，既可使各脏腑失去血液的濡养而功能异常，引起“不荣则痛”的疼痛症状，又可因脉道瘀阻使心脏负压过重，造成其搏动乏力和心肌能量代谢的异常，从而导致心肌缺血、缺氧，若是治疗不当或延误，随着气虚程度的进行性加重，甚至会造成心肌的局部坏死［1］，可见心气亏虚能导致心肌损伤。

另一方面，中医学理论中，固摄是“气”的主要功能之一，其不仅表现在对血液、汗液、唾液、尿液等的约束与调控，亦表现在对各个脏腑经络之气的收摄之中。《素问·生气通天论》中说：“凡阴阳之要，阳密乃固……阳强不能密，阴气乃绝”，人体的阳气是生命之基，若是阳气虚衰，必然会使其固摄失司，阴血和阴津便会损耗，甚至衰竭，从而导致疾病的发生。就CHD而言，心气的亏虚自然会影响其固摄之功，当粥样硬化斑块破裂，内膜受损之时，必然会因为心气失于固摄，造成凝血障碍，导致内膜受损得不到有效的修复，从而加重动脉粥样硬化的程度。

从本研究结果可以看出，心肌细胞Ca2+浓度的升高可通过造成心肌兴奋收缩藕联功能的异常、心肌损伤和加重动脉粥样硬化的程度这三个方面来引发CHD心气虚证，并能加重CHD心气虚证患者的病情，说明心肌细胞Ca2+浓度的变化可以作为CHD心气虚证的评价指标之一，CHD心气虚证的证候实质在一定程度上，可以用心肌细胞Ca2+浓度的变化来揭示。