塞来昔布对食管癌EC109细胞凋亡及机制的影响

赵梦瑶 李思源 肖志伟 蔺茹君 赵晓伟 李 军

1 石河子大学医学院第一附属医院内分泌代谢科(石河子 832000) 2 石河子大学医学院(石河子 830000) 3 新疆军区69296部队(喀什 844000)

塞来昔布作为环氧化酶- 2 (COX- 2) 的特异性抑制剂,在多项实验研究中均被证明其对肝癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌等都具有抑制作用[1- 5]，在抗肿瘤领域得到了广泛应用。但塞来昔布在食管癌中的作用及机制鲜见报道。因此本实验通过培养人食管癌EC109细胞，并测定COX- 2抑制剂塞来昔布对食管癌EC109细胞系COX- 2蛋白表达及凋亡能力的影响，旨在为食管癌的预防和治疗提供新的依据，为食管癌的靶向治疗拓宽空间。

1 材料与方法

1.1 材料

人食管癌EC109细胞系(购自上海中国科学院细胞库)，塞来昔布(购自美国瑞辉公司)，人COX- 2酶联检测试剂盒(购自上海双赢生物科技有限公司)，胎牛血清(FBS，购自美国GIBCO公司)，DMEM培养基(购自美国GIBCO公司)，二甲基亚砜(DMSO，购自美国SIGMA公司)，流式细胞仪(购自美国Becton Dickinson公司)。

1.2.1 细胞培养及实验分组

体外培养EC109细胞，使用终浓度100 μmol/L塞来昔布原液，加入DMSO溶液将细胞分为对照组(0 μmol/L)及干预实验组(20、60、100 μmol/L)。

1.2.2 酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)测定COX- 2蛋白表达。

常规处理EC109细胞，将调整好浓度的EC109细胞转移至6孔板，使用DEME冲洗孔底细胞并加入0、20、60、100 μmol/L不同浓度塞来昔布溶液各1 mL后继续孵育；24 h后将其放入- 20℃冰箱反复冻融并离心后使用。ELISA法测定COX- 2蛋白表达。

图1 不同浓度塞来昔布对EC109细胞凋亡率的影响A.对照组 B.塞来昔布20 μmol/L C.塞来昔布60 μmol/L D.塞来昔布100 μmol/L

1.2.3 流式细胞仪测定不同浓度塞来昔布对EC109细胞凋亡的影响。

将加入0、20、60、100 μmol/L不同浓度塞来昔布溶液的细胞作为实验组，只加入DMSO溶液为对照组；将细胞常规培养24 h后离心，加入PBS溶液洗涤吹打后再离心，调整细胞为合适浓度后加入显影剂孵育15 min，再加入10 μL PI溶液混匀后孵育5 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 不同浓度塞来昔布对EC109细胞COX- 2蛋白表达的影响

塞来昔布在不同浓度(0,20,60,100 μmol/L)情况下处理EC109细胞24 h后，EC109细胞中COX- 2蛋白的表达依次是1.581±0.116，1.226±0.089，0.846±0.076，0.521±0.082，分别与0 μmol/L塞来昔布组相比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，可见细胞内COX- 2蛋白表达随着塞来昔布浓度递增而逐渐减少(P<0.05)(见表1)。

表1 EC109细胞不同浓度塞来昔布处理后COX- 2 蛋白表达

注：均与0 μmol/L的塞来昔布组相比较

2.2 不同浓度塞来昔布对食管癌EC109细胞凋亡的影响

用不同浓度(0、20、60、100 μmol/L)塞来昔布处理EC109细胞24小时。EC109细胞凋亡率依次是1.700±0.557，13.400±1.735，18.766±1.301，28.100±1.997。四组间差异有统计学意义(F=161.843,P<0.05)；可见随着塞来昔布浓度的增加，EC109细胞的凋亡率逐渐增加。(见图1、图2)

图2 不同浓度塞来昔布组凋亡率比较 注：VS 0 μmol/L塞来昔布组*P<0.05

3 讨 论

食管癌(esophageal cancer:EC)是一种恶性程度高的消化道肿瘤。它存在非常显著的地理分布和遗传特色。近年来在中国，食管癌的死亡率虽然逐年下降[6]，但其发病率和死亡率在世界范围内仍处于较高水平，发病率位于世界恶性肿瘤发病率第9位，死亡率位于世界恶性肿瘤死亡率第5位，发病率及死亡率男性均高于女性[7]。食管癌的发生机制目前被认为是多种致癌因素共同作用，干扰了细胞正常增殖和凋亡，从而使癌细胞过度增殖，阻碍细胞凋亡，但具体机制不明。

环氧化酶- 2(COX- 2)作为前列腺素产生过程中的一种诱导酶，在生理状态下较少表达。多项研究证实，COX- 2蛋白是与肿瘤发生、发展相关的重要分子[8],其在多种癌症组织中存在异常高表达[9-11]。近年来，亦有研究证实COX- 2在多种恶性肿瘤的早期诊断及预后评估也有重要作用。据报道，COX- 2蛋白的高表达对胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤的预后呈现负相关[12]，并且COX- 2诱导的慢性炎症可进一步增强致癌细胞信号活性[13]。胡真真[14]的研究证实COX- 2可作为鼻腔鼻窦鳞状细胞癌早期诊断的分子生物标志物，而且COX- 2的表达强度对于该恶性肿瘤的恶性程度及预后的评估也有重要作用。吕歆[15]的研究表明COX- 2蛋白的表达情况能有效预测食管鳞癌的预后。COX- 2在恶性肿瘤的关系研究中越来越重要，对恶性肿瘤中COX- 2的研究也越来越深入。

COX- 2的过度表达与肿瘤的发生、发展、转移密切相关，通过抑制COX- 2的表达可以抑制肿瘤的发展[16-17]。本研究通过应用不同浓度(0,20,60,100 μmol/ L)的塞来昔布对EC109细胞进行处理，结果显示药物浓度为0 μmol/ L时，COX- 2蛋白的表达水平最高为1.581±0.116；药物浓度为100 μmol/ L时，COX- 2蛋白的表达水平最低为0.521±0.082，总体上，COX- 2蛋白的表达水平随着塞来昔布药物浓度递增而逐渐减少，提示塞来昔布能够有效抑制COX- 2蛋白的表达水平,这与Liu[18]等使用美洛昔康作用于食管鳞癌的研究结果相似。国内蔺茹君、李红涛等人的研究同样证实了经塞来昔布具有抑制食管癌细胞增殖的作用。

塞来昔布对食管癌的抑制机制尚不清楚。Sui W等[19]人的研究发现塞来昔布通过作用在血管内皮细胞抑制肿瘤组织的血管生成，降低肿瘤细胞侵袭力。李红涛等[20]人的研究表明塞来昔布诱导EC109细胞凋亡可能与其阻滞细胞周期的有序进行有关。本研究通过使用不同浓度塞来昔布处理食管癌EC109细胞24 h后，观察到药物浓度为0 μmol/ L时，EC109细胞凋亡率最低为1.700±0.557；药物浓度为100 μmol/ L时，EC109细胞凋亡率最高为28.100±1.997，四组间差异有统计学意义(F=161.843,P<0.05)，细胞的凋亡率随着药物浓度的增高而逐渐增加，说明塞来昔布对EC109细胞具有浓度依赖性。张康[21]等通过对不同时间不同浓度的塞来昔布食管癌Eca-109细胞增殖及凋亡研究同样显示塞来昔布对EC109细胞有明显的生长抑制作用。蔺茹君[22]等人在研究COX- 2与MMP-14对食管癌的可能作用机制中，结果表明塞来昔布对ECa109细胞增殖具有抑制作用。陈小龙的研究发现塞来昔布可减少CD4+CD25+调节性T细胞比例并且促进CD3+、CD4+T细胞增殖，进而增强免疫应答，对食管鳞癌具有潜在治疗作用[23]。李红涛[20]等人通过体外研究选择性环氧化酶- 2(COX- 2)抑制剂塞来昔布对人食管癌细胞株Eca-109增殖和凋亡的影响结果同样显示能够显著抑制EC109增殖，诱导凋亡。而本实验使用塞来昔布作用于食管癌EC109细胞，结论提示塞来昔布可能通过抑制COX- 2的表达，进而诱导EC109细胞的凋亡。

综上所述，塞来昔布可以在浓度梯度下抑制EC109细胞系中COX- 2蛋白的表达，诱导食管癌EC109细胞的凋亡，进而起到抗肿瘤的作用。以此为靶点，可为食管癌的诊断及靶向治疗提供依据。