多指标综合加权评分法优选肾衰乙方的提取工艺

张冰冰，张春燕，潘蓉蓉，陈 杰，路建饶*，朱建勇*

(1.上海中医药大学附属第七人民医院肾病科，上海 200137；2.上海中医药大学附属第七人民医院中心实验室，上海 200137)

肾衰乙方处方由制大黄、徐长卿、土茯苓、炒王不留行、陈皮、半夏、黄芪、当归、灵芝、胡芦巴、黄连共11味中药组成，为上海中医药大学附属第七人民医院上海市名老中医叶景华教授的经验方。该方通过对大量慢性肾衰竭病人中药临床治疗的长期观察总结而成，在改善早、中期慢性肾脏病病人的症状体征方面疗效显著[1-2]。本研究旨在按照国家食品药品监督管理总局对医疗机构应用传统工艺配制中药制剂的要求，拟将本院肾病科长期应用于临床的肾衰乙方研制成院内制剂——肾衰乙方颗粒，使该制剂规范化应用于临床，保证药物的安全性、稳定性、有效性和可控性。本研究采用正交试验设计，以大黄酸、大黄素、丹皮酚、落新妇苷、橙皮苷的含量及出膏率为考察指标，对料液比、提取时间、提取次数等因素进行考察，优选肾衰乙方的最佳提取工艺，确保该药物的工艺稳定，质量可控。

1 材 料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；CP225D电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；DL720-A超声清洗仪(上海之信仪器有限公司)；SHZ-D (Ⅲ)循环水式真空泵(郑州博科设备有限公司)；N-1300-WB旋转蒸发仪(日本EYELA公司)；HWS28型电热恒温水浴锅(上海一恒科学实验有限公司)；DNG-9140A电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 药物和试剂 大黄酸对照品(批号110757-201607)、大黄素对照品(批号110756-200110)、丹皮酚对照品(批号110708-201407)、橙皮苷对照品(批号110721-201818)均由中国食品药品检定研究院提供；落新妇苷对照品(批号29838-67-3，上海诗丹德标准技术服务有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。大黄等11味药材均购自上海康桥药业有限公司，经本院药剂科副主任中药师公丕君鉴定，符合2015年版《中华人民共和国药典》(简称药典)相关规定。

2 方法和结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件

2.1.1.1 测定大黄酸、大黄素、丹皮酚的色谱条件 色谱柱为安捷伦Zorbax Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：以0.1%磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～40 min，70%A；40～55 min, 70%～42%A；55～56 min，42%～70%A；56～60 min，70%A；流速1.2 ml/min；柱温30.5 ℃；检测波长274 nm；进样量10 μl。

2.1.1.2 测定落新妇苷、橙皮苷的色谱条件 采用2.1.1.1项下的色谱柱和流动相条件，梯度洗脱：0～15 min, 84%A；15～16 min, 84%～80%A;16～30 min，80%A；30～31 min,80%～84%A;31～35 min，84%A；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：291 nm；进样量：10 μl。

2.1.2 对照品溶液的制备

2.1.2.1 大黄酸、大黄素、丹皮酚对照品溶液的制备 精密称取大黄酸、大黄素、丹皮酚对照品适量，加甲醇溶解，配制成浓度分别为280、45、100 μg/ml的混合对照品溶液，备用。

2.1.2.2 落新妇苷、橙皮苷对照品溶液的制备 精密称取落新妇苷、橙皮苷对照品适量，加甲醇溶解，分别配制成浓度为220、370 μg/ml的混合对照品溶液，备用。

2.1.3 供试品溶液的制备

2.1.3.1 大黄酸、大黄素、丹皮酚供试品溶液的制备 称取日处方药材175 g，加10倍量水，煎煮3次，每次0.5 h，过滤后合并滤液，减压浓缩至350 ml，精密吸取5 ml，加盐酸0.15 ml，混合均匀，加入3倍量的二氯甲烷溶液，萃取3次，合并萃取液，挥干，加甲醇定容至1 ml，即得。

2.1.3.2 落新妇苷、橙皮苷供试品溶液的制备 按2.1.3.1项下方法制备提取液，减压浓缩至350 ml，精密吸取1 ml，置2 ml的容量瓶中，加甲醇定容至2 ml，即得。

2.1.4 阴性对照品溶液的制备

2.1.4.1 缺大黄、徐长卿的阴性对照溶液的制备 称取除大黄、徐长卿之外的药材，按照2.1.3.1项下方法，制备缺大黄、徐长卿的阴性对照溶液。

2.1.4.2 缺土茯苓、陈皮的阴性对照溶液的制备 称取除土茯苓、陈皮之外的药材，按照2.1.3.2项下方法，制备缺土茯苓、陈皮的阴性对照溶液。

2.2 专属性实验

2.2.1 大黄酸、大黄素、丹皮酚专属性实验 分别吸取2.1.2.1项下混合对照品溶液、2.1.3.1项下供试品溶液、2.1.4.1项下阴性对照品溶液各10 μl，按2.1.1.1项下色谱条件进行分析。结果3种指标性成分与其相邻的色谱峰分离度均>1.5，并且各组分互不干扰，理论塔板数符合要求，阴性无干扰，专属性良好。见图1。

2.2.2 落新妇苷、橙皮苷专属性实验 分别吸取2.1.2.2项下混合对照品溶液、2.1.3.2项下供试品溶液、2.1.4.2项下阴性对照品溶液各10 μl，按2.1.1.2项下色谱条件进行分析，两种指标性成分与其相邻的色谱峰分离度均>1.5，并且各组分互不干扰，理论塔板数符合要求，阴性无干扰，专属性良好。见图1。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察

2.3.1.1 大黄酸、大黄素、丹皮酚线性关系考察 精密吸取1、2.5、5、10、15、25 μl的2.1.2.1项下的混合对照品溶液，注入液相色谱仪，按照2.1.1.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以进样量为横坐标(x)，以峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得各组分的线性方程分别为：y大黄酸=924.735 0x-11.577 8(r=1.000 0)，线性范围0.28～7 μg；y大黄素=1 257.458 3x- 1.442 8(r=1.000 0)，线性范围0.045～1.125 μg；y丹皮酚=1 334.709 5x-4.317 8(r=1.000 0)，线性范围0.1～2.5 μg，在相应进样范围内线性关系良好。

2.3.1.2 落新妇苷、橙皮苷线性关系考察 精密吸取1、1.25、2.5、5、10、12.5 μl的2.1.2.2项下的混合对照品溶液，注入液相色谱仪，按照2.1.1.2项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以进样量为横坐标(x)，以峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得各组分的线性方程分别为：y落新妇苷=532.520 5x+18.809 8(r=0.999 0)，线性范围0.22～2.75 μg；y橙皮苷=406.863 8x+5.138 1(r=0.999 9)， 线性范围0.37～3.7 μg，在相应进样范围内线性关系良好。

图1 肾衰乙方的HPLC谱图Figure 1 HPLC chromatograms of Shenshuaiyi decoctionA：大黄酸、大黄素、丹皮酚混合对照品溶液；B：大黄酸、大黄素、丹皮酚供试品溶液；C：缺大黄、徐长卿的阴性对照溶液；D：落新妇苷、橙皮苷混合对照品溶液；E：落新妇苷、橙皮苷供试品溶液；F：缺土茯苓、陈皮的阴性对照溶液；1：丹皮酚；2；大黄酸；3：大黄素；4：落新妇苷；5：橙皮苷

2.3.2 精密度实验

2.3.2.1 大黄酸、大黄素、丹皮酚的精密度实验 精密吸取2.1.2.1项下混合对照品溶液10 μl，按2.1.1.1项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积，计算RSD值。结果大黄酸、大黄素和丹皮酚峰面积的RSD值分别为0.16%、0.19%和0.08%(n=6),表明仪器精密度良好。

2.3.2.2 落新妇苷、橙皮苷的精密度实验 精密吸取2.1.2.2项下混合对照品溶液3 μl，按2.1.1.2项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积，计算RSD值。结果落新妇苷和橙皮苷峰面积的RSD值分别为1.60%和1.73%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性实验

2.3.3.1 大黄酸、大黄素、丹皮酚的重复性实验 按2.1.3.1项下方法分别制备6份供试品溶液，进样10 μl，记录大黄酸、大黄素、丹皮酚的峰面积，计算RSD值。结果大黄酸、大黄素、丹皮酚峰面积的RSD值分别为2.20%、2.35%和2.79%(n=6),表明方法重复性良好。

2.3.3.2 落新妇苷、橙皮苷的重复性实验 按2.1.3.2项下的方法分别制备6份供试品溶液，分别进样10 μl，记录落新妇苷、橙皮苷的峰面积，计算RSD值。结果落新妇苷和橙皮苷峰面积的RSD值分别为1.76%和0.64%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.3.4 稳定性实验

2.3.4.1 大黄酸、大黄素、丹皮酚的稳定性实验 取按2.1.3.1项下方法配制的供试品溶液，分别于室温放置0、2、4、16、24和36 h。按2.1.1.1项下色谱条件进样10 μl，测定峰面积，计算RSD值。结果大黄酸、大黄素、丹皮酚峰面积的RSD值分别为2.17%、2.58%和2.34%(n=6)，表明供试品溶液在36 h内稳定。

2.3.4.2 落新妇苷、橙皮苷的稳定性实验 取按2.1.3.2项下方法配制的供试品溶液，分别于室温放置0、2、4、8、16和32 h。按2.1.1.2项下色谱条件进样10 μl，测定峰面积，计算RSD值。结果落新妇苷和橙皮苷峰面积的RSD值分别为1.09%和0.71%(n=6)，表明供试品溶液在32 h内稳定。

2.3.5 加样回收率实验

2.3.5.1 大黄酸、大黄素、丹皮酚的加样回收率实验 取已知指标成分含量的供试品溶液1份，在线性范围内分别加入一定量的大黄酸、大黄素、丹皮酚对照品溶液，各6份，按2.1.1.1项下色谱条件测定含量。结果大黄酸、大黄素、丹皮酚的平均回收率分别为(100.22±0.90)%、(101.60±2.83)%和(99.67±0.88)%(n=6)，表明本方法加样回收率良好。

2.3.5.2 落新妇苷、橙皮苷的加样回收率实验 按2.3.5.1项下方法在线性范围内分别加入一定量的落新妇苷、橙皮苷对照品溶液，各6份，按2.1.1.2项下色谱条件测定含量，结果落新妇苷和橙皮苷的平均回收率分别为(103.02±2.03)%和(103.70±2.49)%(n=6)，表明本方法加样回收率良好。

2.4 单因素实验

2.4.1 料液比对提取率的影响 称取1日处方量药材，约175 g，共6份，补足吸水量，料液比分别按1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12和1∶14煎煮1次，每次0.5 h，煎液浓缩至350 ml。按2.1.3项下方法分别配制2种供试品溶液。分别按2.1.1项下色谱条件测定含量，结果显示，料液比为1∶4时提取效果最差，选取1∶8、1∶10和1∶12为正交试验料液比进一步考察。

2.4.2 提取时间对提取率的影响 称取1日处方量药材，约175 g，共5份，补足吸水量，加10倍水，煎煮1次，分别煎煮0.5、1、1.5、2、2.5 h，煎液浓缩至350 ml。按2.1.3项下方法分别配制2种供试品溶液。分别按2.1.1项下色谱条件测定含量。结果显示，煎煮2 h和2.5 h的提取效果与1.5 h相当，所以选择0.5、1和1.5 h为正交试验提取时间进一步考察。

2.5 正交试验

2.5.1 正交试验设计 以肾衰乙方处方药材浓缩提取液中5种主成分的含量及干膏得率为指标，采用L9(34)正交试验考察料液比、提取时间、提取次数等因素，优选出最佳的提取工艺。正交试验设计的因素水平见表1。

2.5.2 正交试验方案 按照2.1.3项下方法制备正交设计中各组的供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件测定含量，记录峰面积，计算各供试品溶液中5种主成分的含量，结果见表2。

表1 正交试验设计因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test design

2.5.3 干膏得率的测定 精密量取各组浓缩提取液150 ml，水浴蒸干，置105 ℃的烘箱中干燥至恒重，取出，置干燥器中冷却后，迅速称定重量，计算干膏得率，结果见表2。

2.5.4 正交试验结果分析 根据肾衰乙方中君、臣、佐、使的各指标因素对提取工艺影响大小的差异分配权重系数，即君药大黄中大黄酸含量(W1)的权重系数为0.2，大黄素含量(W2)的权重系数为0.2，君药徐长卿中丹皮酚含量(W3)的权重系数为0.2，臣药土茯苓中落新妇苷含量(W4)的权重系数为0.1，佐药陈皮中橙皮苷含量(W5)的权重系数为0.1，干膏得率(W6)的权重系数为0.2，进行加权求和[3-4]，综合评分W(%)=0.2 W1/Wmax1+ 0.2 W2/Wmax2+0.2 W3/Wmax3+0.1 W4/Wmax4+0.1 W5/Wmax5+0.2 W6/Wmax6。综合加权评价结果见表2和表3。

表2 肾衰乙方提取工艺的L9(34)正交试验分析表Table 2 Analysis table of L9(34) orthogonal test of the extraction technology of Shenshuaiyi decoction

由表3中结果分析可知，各因素对综合评分的影响依次为C>B>A，最优提取工艺为C3B3A2，即料液比1∶10， 提取1.5 h， 提取3次。 考虑到工业化大生产，尽可能节约能源，而A因素下K1和K2没有显著性差异，故选择1∶8的料液比进行大生产，同时B因素下K2和K3没有显著性差异，基于减少中药煎煮过程中成分的变化，故选择煎煮时间为1 h。最后确定最佳提取工艺为加8倍量水，煎煮3次，每次煎煮1 h。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.6 验证实验 称取1日处方量药材，共3份，按照确定的最佳提取工艺C3B2A1进行验证实验，即加入8倍量的水，提取3次，每次1 h，提取液合并浓缩至350 ml，按照2.1.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件测定5种主成分的含量。实验结果见表4，结果显示，该工艺准确可靠，可行性好，可用于工业化生产。

表4 验证实验结果Table 4 The results of verification test

3 讨 论

肾衰乙方中的君药为制大黄、徐长卿，臣药为土茯苓、炒王不留行，佐药为陈皮，故本文选用君药大黄中的大黄酸、大黄素，徐长卿中的丹皮酚，臣药土茯苓中的落新妇苷，佐药陈皮中的橙皮苷作为含量检测指标，其含量测定主要参考2015年版药典(一部)中相关药材项下的含量测定方法[5]。药典中5种指标性成分的检测波长分别为254、274、291和283 nm，但通过实验发现采用波长274 nm和291 nm，能很好地检测到4味药材中主成分的含量，故本研究采用混合对照法双波长来检测肾衰乙方样品，同时结合相关文献[6-8]设计测定方法。

肾衰乙方为名老中医叶景华教授首创的经验方。前期临床研究结果表明，肾衰乙方能够有效降低慢性肾脏病早中期病人的肌酐、尿素氮水平，减轻炎症反应，改善脂质代谢障碍，疗效显著。本研究采用多指标综合加权评分法优选肾衰乙方提取工艺，确定最佳提取方法，为肾衰乙方颗粒制剂的开发提供完备的实验基础，使其作为院内制剂更规范化地应用于临床。