基于响应面法的土茯苓中落新妇苷提取工艺研究

魏玉娇， 郭晓强， 杨淞瑞， 李小红， 何源超， 何顺东， 刘达玉(.成都大学 药学与生物工程学院， 四川 成都 6006；.成都大学 四川抗菌素工业研究所， 四川 成都 6005)

0 引 言

土茯苓为百合科植物光叶菝葜的干燥根茎，收载于《中国药典》2015年版中[1].研究表明，土茯苓具有免疫调节、抗炎、抑菌、镇痛等作用，临床上用于治疗湿热淋浊、筋骨疼痛、头痛等症[2].落新妇苷是土茯苓中关键的活性成分和质量控制指标成分，为二氢黄酮醇苷类化合物，《药典》中规定土茯苓按干燥品计算，落新妇苷含量不得少于0.45%[1，3].目前，对土茯苓中落新妇苷的提取方法有回流提取、微波提取和超声提取等，其中，超声提取相较于回流提取法耗时较少，相较于微波提取法更适合工业生产[4-5].本研究以土茯苓为原料，采用超声法提取其中的落新妇苷，利用HPLC法测定提取液中落新妇苷的含量，并通过响应面法来优化从土茯苓中提取落新妇苷的工艺，拟为土茯苓的实际应用提供参考依据.

1 材料与仪器

1.1 材 料

实验所用材料包括：土茯苓中药饮片(批号，18080279)，购自四川千方中药股份有限公司；落新妇苷对照品(批号，14070401，纯度≥99%)，购自成都普瑞法科技开发有限公司；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯.

1.2 仪 器

2 方 法

2.1 落新妇苷含量测定

2.1.1 样品粉末的制备.

取一定的土茯苓饮片，称重，干燥2 h后称重.再粉碎，过4号筛(60目)，制得样品粉末.

2.1.2 供试品溶液的制备.

精密称取过筛后的样品粉末10 g于具塞锥形瓶中，按照一定的料液比、乙醇浓度、提取时间进行超声提取，然后过滤，合并滤液，浓缩，用无水乙醇定容至250 mL，制得供试品溶液，备用.

2.1.3 对照品溶液的制备.

精密称取干燥至恒重的落新妇苷对照品0.0010 g、0.0030 g、0.0050 g、0.0070 g、0.0090 g于10 mL容量瓶中，用流动相(甲醇—0.1%冰醋酸=35∶65)溶解并定容到10 mL，制成浓度分别为0.10 mg/mL、0.30 mg/mL、0.50 mg/mL、0.70 mg/mL、0.90 mg/mL的系列对照品溶液.

2.1.4 色谱条件.

实验的色谱条件为：色谱柱为SinoChrom ODS-BP 5 μm(4.6 mm×150 mm)，流动相为甲醇—0.1%冰醋酸(35∶65，v/v)，流速1.0 mL/min，检测波长291 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL.

分别取对照品溶液和供试品溶液进行分析，落新妇苷和其他杂质均可完全分离，峰形符合要求，结果如图1和图2所示.

图1 落新妇苷对照品HPLC图

图2 供试品HPLC图

2.1.5 线性关系.

分别精密吸取落新妇苷对照品溶液适量，用流动相稀释成质量浓度分别为0.0167 mg/mL、0.0500 mg/mL、0.0833 mg/mL、0.1167 mg/mL、0.1500 mg/mL的系列对照品溶液.吸取各对照品溶液10 μL，按“2.1.4"项下的色谱条件进行分析.以质量浓度C(mg/mL)为横坐标、峰面积积分值A为纵坐标，绘制标准曲线，得落新妇苷的回归方程为，A=2×107C+102 934(R2=0.999).结果表明，落新妇苷在0.0167～0.1500 mg/mL范围内线性关系良好.

2.1.6 精密度.

分别精密吸取落新妇苷对照品溶液10 μL，连续进样6次，得到落新妇苷的峰面积积分值，计算其RSD值为0.06%(n=6).结果表明，仪器精密度良好.

2.1.7 稳定性.

精密吸取同一个供试品溶液适量，分别于0、2、4、6、8、10 h内各进样10 μL，测定落新妇苷的峰面积积分值，计算其RSD为0.04%(n=6).结果表明，供试品溶液在10 h内基本稳定.

2.1.8 重复性实验.

取同一批次的样品粉末共6份，分别按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，测定落新妇苷的含量，计算其RSD为0.11%(n=6).结果表明，测定方法重复性良好.

2.1.9 回收率.

精密量取已知落新妇苷浓度的样品溶液2 mL，共5份，每份分别精密加入落新妇苷对照品溶液各100 μL(共0.2 mg)，用流动相定容制备成供试品溶液，按“2.1.4”项下的色谱条件进行测定，计算落新妇苷的平均回收率为99.27%，RSD为1.10%，结果见表1.

表1 供试品中落新妇苷的平均回收率

2.2 单因素实验.

2.2.1 乙醇浓度对落新妇苷含量的影响.

固定料液比为1∶20(g∶mL)，超声波法提取落新妇苷，提取时间30 min，考察乙醇浓度(50%、60%、70%、80%、90%、95%)对土茯苓提取物中落新妇苷含量的影响，共做3组平行实验，取平均值.

2.2.2 提取时间对落新妇苷含量的影响.

固定料液比为1∶20(g∶mL)，乙醇浓度为80%，超声波法提取落新妇苷，考察提取时间(15、30、60、90、120 min)对土茯苓提取物中落新妇苷含量的影响，共做3组平行实验，取平均值.

2.2.3 料液比对落新妇苷含量的影响.

固定乙醇浓度为80%，提取时间为90 min，超声波法提取落新妇苷，考察料液比(1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40(g∶mL))对土茯苓提取物中落新妇苷含量的影响，共做3组平行实验，取平均值[4].

2.3 响应面实验设计

根据单因素实验结果，选取乙醇浓度(X1)，提取时间(X2)和料液比(X3)3个因素作为自变量，以土茯苓提取液中落新妇苷含量为因变量，进行响应面分析，优化土茯苓中落新妇苷的提取工艺，因素水平见表2.

表2 土茯苓中落新妇苷提取工艺的因素水平

3 结果与分析

3.1 单因素实验

3.1.1 乙醇浓度对提取液中落新妇苷含量的影响.

乙醇浓度对提取液中落新妇苷含量的影响如图3所示.

图3 乙醇浓度对提取液中落新妇苷含量的影响

由图3可知，固定料液比和提取时间，随着乙醇浓度的不断增大土茯苓提取液中落新妇苷含量呈现先增加后降低之趋势，乙醇浓度为80%时达到最大，当乙醇浓度大于80%时，落新妇苷含量下降明显.故，初步确定提取溶剂乙醇浓度为80%.

3.1.2 料液比对提取液中落新妇苷含量的影响.

料液比对提取液中落新妇苷含量的影响如图4所示.

图4 料液比对提取液中落新妇苷含量的影响

由图4可知，固定乙醇浓度和提取时间，样品粉末与提取液的比例为1∶10(g∶mL)时，落新妇苷的含量最高.故，初步确定提取料液比为1∶10(g∶mL).

3.1.3 提取时间对提取液中落新妇苷含量的影响.

提取时间对提取液中落新妇苷含量的影响如图5所示.

图5 提取时间对提取液中落新妇苷含量的影响

由图5可知，固定乙醇浓度和料液比，随着提取时间的不断增大，落新妇苷含量也增大，当提取时间为90 min时，落新妇苷含量最高.故，初步确定提取时间为90 min.

3.2 响应面法分析

3.2.1 回归模型的建立和方差分析.

根据BOX-Behnken实验设计原理和单因素实验结果，以乙醇浓度、料液比、提取时间为研究因素，提取液中落新妇苷含量为响应值.采用三因素三水平响应面分析方法，进行响应面分析实验，结果见表3，方差分析见表4.

表3 土茯苓中落新妇苷提取工艺响应面方案设计及实验结果

以提取液中落新妇苷含量为响应值的线性回归方程为，

Y=0.046+1.750E-003A+6.500E-003B-4.500E-003C+2.500E-004AB+5.750E-003AC-3.750E-003BC-0.016A2-0.016B2-9.125E-003C2(R2=0.951).

表4 土茯苓中落新妇苷提取工艺回归分析结果

由表4可知，回归模型达到显著水平，失拟项不显著(P>0.05)，说明方程对实验的拟合程度较高，使用该方程模拟真实的三因素三水平分析是可行的，即本实验所得二次回归方程与实际情况吻合度较好.A、C、AB、AC、C2对结果的影响表现为显著(P<0.05)，各因素对土茯苓中落新妇苷提取工艺的影响大小依次为提取时间、乙醇浓度、料液比.

3.2.2 响应曲面分析.

为了进一步研究变量之间的相互作用，应用Design Expert 8.0.6软件模拟了各个因素对落新妇苷含量影响的3D响应曲面图和等高线图，结果见图6～图8.

由6图可知，响应面曲线变化相对陡峭，等高线呈椭圆形，表明乙醇浓度和料液比的交互作用明显，对土茯苓提取液中落新妇苷含量的影响也较为显著.当乙醇浓度与提取时间适当增加时，落新妇苷的含量也随之增大，且有稳定的最大值.

由图7可知，乙醇浓度和提取时间的交互作用对土茯苓提取液中落新妇苷含量的影响明显，等高线稀疏且呈椭圆形，而且弧度较大，说明两因素的交互作用比较明显.

由图8可知，响应曲面变化较平缓，等高线近似圆形，说明料液比和提取时间的交互作用不明显，且对土茯苓提取液中落新妇苷含量的影响相对不显著，随着提取时间和乙醇浓度的同时增大，落新妇苷的含量呈先增大后降低的抛物线趋势[6-8].

同时，本研究利用Design Expert 8.0.6软件对回归模型进一步分析，得到土茯苓中落新妇苷提取工艺的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度为67.7%，提取时间为87.5 min，料液比为1∶10.3(g∶mL)，在上述提取工艺条件下土茯苓提取液中落新妇苷的含量理论值为0.0621 mg/mL.

图6 乙醇浓度和料液比交互作用对土茯苓提取液中落新妇苷影响的响应面图

图7 乙醇浓度和提取时间交互作用对土茯苓提取液中落新妇苷影响的响应面图

图8 提取时间和料液比交互作用对土茯苓提取液中落新妇苷影响的响应面图

3.2.3 验证实验.

为了验证响应面法优化结果的可靠性，同时考虑到实际情况和操作方便，修正后的优化条件为：提取时间为90 min，乙醇浓度为70%，料液比为1∶10(g∶mL).进行3次平行实验，取平均值，并将预测值与实测值进行统计，结果见表5.

表5 验证实验结果

由表5可知，预测值与实测值之间的平均偏差为2.0%(<5%)，说明本实验所建立的数学模型具有良好的预测性，该提取工艺准确可行.

4 结 论

本研究通过响应面法优化土茯苓中落新妇苷提取工艺为：提取时间为87.5 min，乙醇浓度为67.7%，料液比为1∶10.3(g∶mL)，土茯苓提取液中落新妇苷含量的预测值为0.0621 mg/mL.验证实验结果显示，预测值与实测值之间的平均偏差为2.0%，说明本实验所建立的数学模型具有良好的预测性，该提取工艺准确可行.根据优化结果和实验操作条件，最终确定土茯苓中落新妇苷的提取工艺为：提取时间为90 min，乙醇浓度为70%，料液比为1∶10(g∶mL)，实验测定土茯苓提取液中落新妇苷平均含量为0.0611 mg/mL.本研究结论可为土茯苓的实际应用与开发提供参考依据.