新型氮唑类化合物的合成及抗真菌活性研究

武锬洋，王 轲，王朝明，柴晓云*

(1.海军军医大学药学系有机化学教研室,上海 200433;2.海军军医大学基础医学院本科生,上海 200433)

近年来，深部真菌感染的患病率和致死率在全球呈上升趋势[1-2]。目前，临床治疗深部真菌感染的常用药物为氮唑类(如氟康唑)、多烯类(如两性霉素B)、棘球菌素类(如卡泊芬净)等。与其他药物相比，氮唑类药物具有高效、低毒、广谱、稳定性较强及价格较低等优势。氮唑类药物的作用机制主要是通过抑制24-亚甲基双氢羊毛甾醇的14α-去甲基化反应而抑制真菌麦角甾醇的生物合成，从而达到抑制真菌生长的目的[3]。然而，氮唑类药物具有肝、肾毒性，抗菌谱窄和耐药性问题严重等缺点。因此，寻找高效、低毒、广谱的新型抗真菌药物越来越受到临床和科研工作者的关注[4-9]。本课题组多年来一直从事氮唑类抗真菌药物的研究工作，有着较好的研究基础与经验。结合大量的研究结果[10-12]，作者在保留氮唑类抗真菌药物基本骨架不变的基础上，通过亲核取代反应和Click反应，引入取代苯基氮唑侧链或噻吩基氮唑侧链来调节整个分子的电性性质、空间结构和脂水分配系数，以期改善化合物的抗真菌活性及真菌耐药性。

1 材 料

1.1 仪器和试药 ME203E/02电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；85-2型恒温磁力搅拌器(上海志威电器有限公司)；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵(上海豫康科教仪器设备有限公司)；CCA-20低温冷却水循环泵(巩义予华仪器有限公司)；Bruker AC-300P核磁共振仪(瑞士Bruker公司)；Agilent LC/MSD SL型质谱仪(美国Agilent Technologies公司)。氟康唑、伊曲康唑[锑希爱(上海)化成工业发展有限公司];酮康唑、特比萘芬(上海泰坦科技股份有限公司)。合成所用试剂均为化学纯或分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司或上海泰坦科技股份有限公司。柱层析硅胶(300～400目，烟台江友硅胶开发有限公司)。

1.2 菌种 白念珠菌(Y0109)、白念珠菌(SC5314)、新生隐球菌(32609)、近平滑念珠菌(ATCC22019)、近平滑念珠菌(537)、红色毛癣菌和薰烟曲霉菌(07544)由海军军医大学长征医院皮肤性病与真菌病研究所提供并检测。

2 方法和结果

2.1 合成路线 本研究共设计合成了10个未见文献报道的化合物，目标化合物3a～3j的合成路线见图1。

图1 目标化合物3a～3j的合成路线及化学结构Figure 1 Synthetic routes and chemical structures of the target compounds 3a-3j

2.1.1 中间体2的合成 将购买的中间体1cis-甲磺酸-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基甲基)-1,3-二氧戊环-4-基]甲酯40.8 mg(0.1 mmol,1 eq)加入100 ml圆底烧瓶中，加入叠氮化钠26 mg(0.4 mmol,4 eq)，磁力搅拌下缓慢滴加二甲亚砜(DMSO)1 ml,加热至120 ℃,反应2 h，薄层色谱法(TLC)检测至反应完全。过滤，用二氯甲烷萃取，有机相用蒸馏水洗涤3次，无水硫酸钠干燥12 h，过滤、浓缩，得中间体2。

2.1.2 目标化合物3a～3j的合成 将中间体2 35.5 mg(0.1 mmol,1 eq)加入100 ml圆底烧瓶中，加入取代的炔(0.4 mmol,4 eq)，CuSO4·5H2O 25 mg(0.1 mmol,1 eq)和抗坏血酸钠19.8 mg(0.1 mmol,1 eq)，再加入DMSO 1 ml。室温下磁力搅拌反应3～5 h，TLC检测至反应完全。过滤，用二氯甲烷萃取，有机相用蒸馏水洗涤3次，无水硫酸钠干燥12 h，减压浓缩，经硅胶柱层析和二氯甲烷重结晶，得到目标化合物3a～3j。合成的10个化合物的MS(M+H)+及1H-NMR数据见表1。

2.2 药理实验 选用1.2项下7种实验真菌菌株，参照美国国家临床实验室标准委员会 (NCCLS) 推荐的标准化抗真菌敏感性实验方法[13]测定。目标化合物3a～3j的药理活性测定结果见表2。体外抗真菌活性筛选结果表明，大多数目标化合物对7种临床常见真菌均表现出较好的抑制活性。化合物3h和3i对白念珠菌(SC5314)的抑菌活性[生长抑制率为80%时的最小抑制浓度(MIC80)=0.125 μg/ml]是特比萘芬(MIC80=1 μg/ml)的8倍,是氟康唑(MIC80=0.25 μg/ml)的2倍；对白念珠菌(Y0109)的抑制活性(MIC80=0.125 μg/ml)是特比萘芬(MIC80=0.5 μg/ml)的4倍，是氟康唑(MIC80=0.25 μg/ml)的2倍。化合物3h和3i对近平滑念珠菌(537)的MIC80为0.125 μg/ml，是特比萘芬和氟康唑(MIC80均为2 μg/ml)的16倍。同时，化合物3d对近平滑念球菌(ATCC22019)的抑制作用(MIC80=0.25 μg/ml)是氟康唑(MIC80=2 μg/ml)的8倍，是特比萘芬(MIC80=1 μg/ml)的4倍。化合物3h对红色毛藓菌的抑菌活性也较好(MIC80=0.5 μg/ml)，是氟康唑(MIC80=4 μg/ml)的8倍，与特比萘芬(MIC80=0.5 μg/ml)相当，但总的抑菌活性不如伊曲康唑强。

表1 目标化合物3a～3j的产率及波谱数据Table 1 The yield, 1H-NMR and MS data of the target compounds 3a-3j

3 讨 论

文献报道[10-12]，氮唑类化合物的侧链对化物抗菌活性有较大的影响。本研究通过亲核取代反应和Click反应，引入取代苯基氮唑侧链或噻吩基氮唑侧链，共合成10个氮唑类衍生物3a～3j，其中Click反应是合成的关键步骤。上述化合物合成以DMSO作为溶剂，在常温下搅拌反应，终产物中DMSO难以除净，导致核磁谱中有DMSO的杂质峰。因此在后期合成中，作者通过多次萃取、洗涤以去除产物中的DMSO。体外抗真菌活性结果表明，大部分目标化合物对7种临床常见真菌均表现出较好的生长抑制活性。与氟康唑和特比萘芬相比，在保持氮唑类抗真菌药物基本骨架不变的情况下，侧链引入具有较好抗菌活性的苯基氮唑侧链或噻吩基氮唑侧链，能够有效地增强氮唑类衍生物的抗真菌活性，扩大抗菌谱。本研究为抗真菌药物的研究奠定了良好的基础。

表2 目标化合物对7种真菌的体外抑菌活性(MIC80a)Table 2 In vitro antifungal activity(MIC80) of the target compounds against 7 kinds of pathomycete (ρB/μg·ml-1)