冷藏处理方式对大目金枪鱼贮藏品质及内源酶活性的影响

蓝蔚青 胡潇予 李诗慧 袁艳芳 谢 晶*

（1 上海海洋大学食品学院 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心 上海201306

2 上海市杨浦区市场监督管理局 上海200082）

金枪鱼（Tuna）又名鲔鱼、吞拿鱼，主要分布于大西洋、印度洋和太平洋，属海洋洄游性鱼类，其主要品种有黄鳍金枪鱼（Thunnus albacares）、大目金枪鱼（Thunnus obesus）、蓝鳍金枪鱼（Thunnus thynnus）和鲣鱼（Katsuwonus pelamis）等，是典型的低脂、高蛋白鱼类，体内富含维生素与多不饱和脂肪酸，具有很高的营养价值[1-2]。金枪鱼死后呼吸停止，体内的三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）在内源酶的作用下降解为二磷酸腺苷（Adenosine diphosphate，ADP）和一 磷 酸 腺 苷（Adenosine Monophosphate，AMP）。同时还在腺苷脱氨酶（Adenosine deaminase，ADA）和酸性磷酸酶（Acid Phosphatase，ACP）作用下进一步分解为肌苷（Inosine，HxR）和次黄嘌呤（Hypoxanthine，Hx），产生腐败异味[3-4]。金枪鱼在低温贮藏过程中的品质劣变现象与其体内ATP的降解、内源酶活性变化息息相关。此外，保水性是水产品加工贮藏的关键因素，也是决定其品质的重要指标。肌原纤维内结合水和不易流动水脱离是导致其品质劣变、质构变化的主因。研究水产品在低温贮藏物流过程中的水分迁移规律以及与鲜度相关的特征数据变化具有重要意义。

低场核磁共振（Low-field nuclear magnetic resonance，LF-MNR）技术主要是根据鱼肉样品中H原子核在交变磁场下发生能级跃迁产生核磁共振信号，来反映鱼肉中水分状态变化和迁移的规律。该技术凭借能快速、无损检测样品内部结构、油脂、水分和蛋白质等指标变化的特点，应用于测定水产品中的水分状态，评价其货架期及品质变化[5-7]。生鱼片在金枪鱼市场上有极大的需求，然而超市低温冻藏售卖过程的极大的温度波动与反复冻融问题使生鱼片的口感与营养价值大打折扣。常规冷藏难以长时间维持其鲜度。为保持生食金枪鱼片的良好口感与食用品质，延长其在超市陈列售卖与家庭冷藏保鲜的货架期，有必要研究其不同冷藏条件下的理化指标变化[8]。目前，国内外部分学者研究了水产品冷链贮藏过程中ATP降解关联产物含量的变化与相关酶活性。张龙腾等[9]通过相关性分析发现ADA和ACP活性变化虽不能准确表征鲢鱼在微冻贮藏过程中ATP关联产物含量的变化，但对传统鲜度指标的测定结果有参考意义。Li等[10]以冷链贮藏过程中的鲤鱼为对象，探究微生物在鲤鱼贮藏期间ATP降解中的作用，结果发现微生物在贮藏后期影响其ACP活性及HxR转化为Hx的过程。相关研究表明，冰藏可有效延长水产品的冷藏货架期，而流化冰凭借其冰粒细小圆滑，载冷高，可实现快速降温等特点在水产品保鲜领域得到广泛关注[11-12]。本试验主要将大目金枪鱼分别进行碎冰与流化冰处理，以未经任何处理的冷藏样品作为对照组，3组样品置于4℃贮藏，通过理化指标（质构特性、电导率与挥发性盐基氮）、微生物指标（菌落总数）、ATP关联产物与酶活（腺苷脱氨酶、酸性磷酸酶），并结合低场核磁共振技术测定其在贮藏过程中的水分迁移规律，为大目金枪鱼的品质评价与保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料

大目金枪鱼由浙江丰汇远洋渔业有限公司于2017年6月捕捞于太平洋近海，经船上屠宰、冷冻后直接抽真空冻藏于-55℃，购自上海海洋大学海洋科学学院。

1.2 主要试剂

轻质氧化镁、硼酸、氯化钠、高氯酸、氢氧化钾，国药集团化学试剂有限公司，均为国产分析纯；平板计数琼脂，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾（色谱纯），上海安谱科学仪器有限公司；标准品（三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、肌苷酸、次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷），Sigma公司；蛋白定量（双缩脲法）测试盒、腺苷脱氨酶活性测试盒和酸性磷酸酶活性测试盒，南京建成生物工程研究所有限公司。

1.3 主要设备、仪器

RF-1000W-SP型海水流化制冰机，南通瑞友工贸有限公司；LDZM-40KCS-Ⅲ型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗机械厂；FJ200-S型数显高速均质机，杭州齐威仪器有限公司；LHS-100CL型恒温恒湿箱，上海一恒科学仪器有限公司；H-2050R型台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Kjeltec2300型凯氏定氮仪，瑞士FOSS公司；DDB-11A型便携式电导率仪，杭州齐威仪器有限公司；Waters e2695型高效液相色谱仪，美国Waters公司；Meso MR23-060H-I型核磁共振分析系统，上海纽迈电子科技有限公司等。

1.4 试验方法

1.4.1 原料处理 将真空包装的金枪鱼样品切成小块，每块约100 g，用封口袋包装，迅速分组，分组情况见表1。每天测定各组样品的各项指标。

表1 大目金枪鱼样品的处理方式Table1 The treatment methods of big-eye tuna（Thunnus obesus）

1.4.2 质构分析（Texture profile analysis，TPA）将金枪鱼切成2.0 cm×2.0 cm×1.5 cm的鱼块，选择TPAP/50圆柱形测定探头，依据Li等[13]法进行金枪鱼肉的质构分析。

1.4.3 电导率 参考胡玥等[14]方法并稍作修改。称取1g大目金枪鱼碎鱼肉于烧杯中，加入蒸馏水9mL，搅拌均质，室温静置30min后过滤，取上清液用电导率仪测定其电导率值。

1.4.4 总挥发性盐基氮（Total volatile base-Nitrogen，TVB-N）依据Goulas等[15]方法进行不同冷藏条件大目金枪鱼肉的挥发性盐基氮含量测定。

1.4.5 菌落总数（Total viable count，TVC）参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数》[16]进行菌落总数测定，每个稀释度作2个平行。

1.4.6 ATP关联产物 参考Liu[17]法并稍作修改。称取5 g鱼肉肉糜，加入体积分数10%的冷HClO4溶液，搅拌均质，于4℃10 000 r/min离心15 min。弃上清液，在沉淀中加入5%的HClO4溶液搅拌均匀，于上述条件下离心，弃上清液，重复该步骤2次，取上清液，用10mol/L KOH和1mol/L KOH调节pH值至6.5，静置30min后过滤。滤液用超纯水定容50mL，用0.45μm滤膜过滤，分装后保存于-20℃冰箱中待测。与鲜度相关的K值、Ki值、P值、H值及Fr值的计算参考Song等[18]法，具体公式如下：

1.4.7 腺苷脱氨酶和酸性磷酸酶活性 称取1g鱼肉肉糜，加入9mL 8.5 g/L冷NaCl溶液，均质20 s，于4℃550 g离心10min，取上清液。利用双缩脲法测定蛋白质浓度[19]。腺苷脱氨酶（ADA）和酸性磷酸酶（ACP）的活性分别采用ADA、ACP试剂盒测定。

1.4.8 低场核磁共振 将金枪鱼鱼肉切成3 cm×3 cm×1.5 cm大小的鱼块，用保鲜膜包裹，放入核磁检测管中。采用CPMG序列，测定温度为32℃。参考CHENG等[20]的T2测定参数设置，得到的序列指数衰减曲线图经分析软件进行批量反演，获得不同时期金枪鱼鱼肉横向弛豫时间T2谱图。

1.5 数据处理

利用SPSS19.0对数据进行相关性及单因素方差分析，采用Duncans法进行显著性分析和多重比较，差异显著水平P＜0.05，结果以平均值±标准偏差表示。用Origin 7.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 冷藏处理对大目金枪鱼质构特性的影响

由表2可看出，不同冷藏条件下大目金枪鱼的硬度、弹性和咀嚼性均随贮藏时间的延长而下降，这是由于大目金枪鱼贮藏期间的鱼肉蛋白质在组织蛋白酶、内源酶和微生物作用下发生不同程度的降解变性，肌纤维蛋白和肌肉结缔组织遭到破坏，鱼肉质地变得松软，质构特性显著降低（P＜0.05）。大目金枪鱼样品的初始硬度值、弹性值和咀嚼性分别为（1049.63±100）g、0.66±0.006与273.98±2.42，7 d后冷藏组样品的硬度值、弹性值和咀嚼性分别降至（455.9±49.48）g、0.47±0.02与82.38±9.45。与碎冰、流化冰处理组样品相比，其降幅明显，且整个贮藏期间冷藏组的质构分析结果均低于其它两组，说明贮藏期间的冰温与冷藏相结合可较好地保护鱼肉质地，这与Yang等[21]对冷藏条件下草鱼硬度的变化研究结果一致。此外，Bao等[22]在研究微冻对圆头鲂鱼尸僵变化时也有类似发现。相较于冷藏与传统碎冰组，流化冰处理组样品能更好地抑制微生物的生长代谢和组织蛋白酶、内源酶的活性，延缓鱼肉肌纤维蛋白降解和水分流失，维持鱼的硬度、弹性和咀嚼性等质地特性，在一定程度上维持肌肉组织的持水性和肌肉结构的完整性，较好地保持其食用品质[23]。

2.2 冷藏处理对大目金枪鱼电导率值的影响

电导率是与水产品鲜度高度相关的重要指标，反映溶液的导电能力。

由图1可知，各组大目金枪鱼样品的电导率随着贮藏时间的延长而升高，其中冷藏组上升速度最快，其次是碎冰处理组，流化冰处理组样品的电导率明显低于前两组。4℃冷藏组金枪鱼样品的电导率在第7天达（1 926.67±143.64）μS/cm，而碎冰组和流化冰组分别维持在（1 522.67±59.05）μS/cm和（1 366.67±2.08）μS/cm；碎冰处理组样品在第9天时的电导率值升至（1 783±63.22）μS/cm，流化冰处理组在第12天达（1 760±36.06）μS/cm。电导率上升的原因可能是大目金枪鱼死后细胞发生自溶现象，细胞内多种营养物质在酶和微生物的作用下分解成具有导电能力的离子和小分子代谢产物，增强了细胞浸出液的导电能力[24]。由此可见，流化冰冷却的冰温环境能更好地抑制微生物污染与酶活性的释放，减缓小分子代谢产物的积累，保持其鲜度。这与蓝蔚青等[25]在研究复合保鲜剂对冰藏鲳鱼品质的影响时发现的电导率变化规律相一致。

表2 不同冷藏处理对大目金枪鱼硬度值、弹性值与咀嚼性的影响Table2 Effect of different refrigerated treatments on hardness，springiness and chewiness of big-eye tuna

2.3 冷藏处理对大目金枪鱼TVB-N值的影响

TVB-N值可在一定程度上反映水产品的蛋白质氧化降解程度，参照GB/T18108-2008《鲜海水鱼》[26]，TVB-N值＜15mgN/100 g为一级鲜度，15 mgN/100 g≤TVB-N值＜20mgN/100 g为二级鲜度，TVB-N值＞30mgN/100 g为腐败。

从图2可知，3种样品在贮藏期间的TVB-N值均呈显著增长趋势（P＜0.05），说明大目金枪鱼的品质随着贮藏时间的延长而发生劣变。贮藏初期，大目金枪鱼的初始TVB-N值为（10.87±0.56）mgN/100 g，在一级鲜度范围标准。贮藏第7天时，对照组的TVB-N值迅速升至（22.16±0.07）mgN/100 g，此时碎冰和流化冰处理组均未超过20 mgN/100 g，说明冰温冷藏可通过对酶活和微生物的抑制作用来延缓蛋白质分解和鱼体腐败变质。而第9天时，碎冰组样品的TVB-N值迅速升至（20.83±0.49）mgN/100 g，流化冰组样品的TVB-N值还处于缓慢上升阶段，未超过二级鲜度标准，这是由于鱼体在细菌及内源酶的共同作用下，蛋白质分解产生挥发性氨、三甲胺和二甲胺等低级胺类化合物，导致TVB-N值逐渐上升[27]。由此说明流化冰比碎冰降温效果好，能较好地维持鱼体低温环境，抑制其蛋白质分解和品质劣变。这与Li等[28]研究的大比目鱼在冷藏条件下生化品质变化规律一致。

图1 不同冷藏处理对大目金枪鱼电导率值影响Fig.1 Effect of different refrigerated treatments on electric conductivity of big-eye tuna

图2 不同冷藏处理对大目金枪鱼TVB-N值的影响Fig.2 Effect of different refrigerated treatments on TVB-N value of big-eye tuna

2.4 冷藏处理对大目金枪鱼菌落总数的影响

大目金枪鱼菌落总数的变化如图3所示。通常把菌落总数值为6.0 CFU/g作为海水鱼腐败的阈值。

图3 不同冷藏处理对大目金枪鱼菌落总数的影响Fig.3 Effect of different refrigerated treatments on TVC of big-eye tuna

由图3可知，样品初始菌落总数为（4.33±0.04）CFU/g，可能由于鱼体自身带有的微生物或处理过程与器具接触等原因所致。在贮藏期内碎冰处理组样品的菌落总数始终高于流化冰组，说明流化冰处理比碎冰处理能更好地降低鱼体贮藏温度，有利于大目金枪鱼的贮藏品质。3种贮藏条件下金枪鱼样品的菌落总数均随贮藏时间的延长而增长，两个冰藏组明显低于4℃冷藏组，说明冰藏与流化冰贮藏均可有效抑制大目金枪鱼肉微生物的增殖。

2.5 冷藏处理对大目金枪鱼ATP关联产物的影响

大目金枪鱼在不同冷藏处理下各ATP关联产物含量的变化如图4所示。

由图4可知，ATP的初始值为（1.91±0.02）μmol/g，3种贮藏方式下样品1 d的ATP含量明显下降，随后稳定在较低浓度水平。由于浓度较低，变化较小，3组无显著差异，这与Shi等[29]对鲢鱼贮藏过程中ATP含量的研究结果一致。IMP含量与鱼体鲜度紧密相关，而HxR与Hx是ATP的主要降解产物。贮藏期间，IMP随着贮藏时间的延长，逐渐降解为具有腐败气味的HxR和Hx，鱼体鲜度下降。从图4还可看出，IMP含量在贮藏过程中逐渐下降，流化冰组样品的IMP含量始终高于其它两组；HxR含量呈先升后降的趋势，主要是由于前期IMP分解成HxR的速率快于HxR降解为Hx的速率，从而造成短期内HxR的积累。样品在贮藏后期，随着外源微生物和外源酶的作用，使HxR降解为Hx的速率加快，鱼体品质急剧下降，产生腐败气味；Hx在整个贮藏期间呈不同程度地增加，而流化冰处理组的Hx累积速率最慢，这可能是由于流化冰处理在一定程度上抑制酶活性与IMP降解速率，减缓ATP降解产物及Hx的积累，进而延缓鱼体的腐败变质。

2.6 冷藏处理对大目金枪鱼K值及相关值的影响

K值常被用来表征鱼体鲜度，数值越低其鲜度越好[30]。通常K值＜20%的鱼肉为一级品，20≤K值＜40%为二级品，K值＞60%为初期腐败鱼。大目金枪鱼在不同冷藏条件下的K值变化如图5a所示。

图4 不同冷藏处理对大目金枪鱼ATP关联产物含量的影响Fig.4 Effect of different refrigerated treatments on ATP-related compounds content of big-eye tuna

由图5可知，大目金枪鱼的初始K值为（13.33±0.01）%，随着贮藏时间的延长，3组金枪鱼的K值均逐渐上升。冷藏组样品第3天时K值超过二级鲜度标准，第7天时迅速增长（66.75±0.028）%，表明样品腐败。此时碎冰处理组样品未达60%，流化冰处理组仍处于二级鲜度，增长缓慢，说明流化冰处理比碎冰与冷藏处理的保鲜效果好。有研究表明，除K值外，Fr、H、Ki等值也可用来描述鱼体新鲜度变化[18]。由图5b与5c可知，整个贮藏期间，Ki、H值的变化趋势与K值基本相似，呈不同程度的增长趋势，且流化冰处理组均低于其它两组。这主要是Ki、H值与K值均体现ATP降解产物HxR和Hx含量的总体水平，表明流化冰可在一定程度上抑制ATP降解及产物积累，维持其新鲜度。Fr值反映鲜味物质IMP含量的水平，大目金枪鱼随着贮藏时间的延长，鲜度下降，Fr值随之降低，该结果与IMP含量变化一致。

图5 不同冷藏处理对大目金枪鱼ATP降解相关值影响Fig.5 Effect of different refrigerated treatments on ATP-related values of big-eye tuna

2.7 冷藏处理对大目金枪鱼内源酶活性的影响

酸性磷酸水解酶和腺苷脱氨酶是ATP降解过程中的两种重要酶类。腺苷脱氨酶（ADA）能促进AMP降解生成IMP，酸性磷酸水解酶（ACP）则主要催化IMP生成HxR。

由表3可知，两种酶的初始活性分别为（13.55±0.25）U/mg和（15.33±0.03）U/g，酶活性在贮藏前期的变化均无明显规律，这与Li等[31]对鲤鱼死后72 h内ATP关联酶活性的研究结果一致。样品在贮藏后期，两种酶活性呈增长趋势，这可能是后期微生物生长繁殖产生大量外源酶而导致其活性升高，加速了鱼体腐败[10，31]。ACP和ADA活性虽在前期不能准确表征ATP关联物含量及金枪鱼鲜度的变化，但ACP活性可在贮藏后期作为大目金枪鱼鲜度的参考指标。

表3 不同冷藏处理对大目金枪鱼腺苷脱氨酶和酸性磷酸酶活性的影响Fig.3 Effect of different refrigerated treatments on the activity of ADA and ACP of big-eye tuna

2.8 冷藏处理对大目金枪鱼水分迁移的影响

水是水产品中极其重要的化学组分，其存在状态和分布情况同水产品的食用品质紧密相关[32]。通过LF-NMR横向弛豫时间T2的测定结果区分金枪鱼肌肉组织中结合水、不易流动水和自由水等3种的水分状态，对应的横向弛豫时间分别为T21，T22，T23。

由图6可知，T21（0～10ms）弛豫时间最短，变化趋势不明显，可能是这部分结合水与蛋白质大分子结合紧密，流动性较差；T22（10～100ms）弛豫时间呈明显上升趋势，不易流动水峰面积逐渐下降，表明随着贮藏时间的延长，肌原纤维内的水分流动性增强，不易流动水不断流失，且流化冰处理可在一定程度上减缓肌原纤维内的水分流失。自由水A23峰面积大致保持升高趋势，4℃冷藏组升高最快，表明自由水含量增加，不易流动水向外流失转变为部分自由水，保证细胞内部水分的平衡[33]。肌肉中的水分状态会影响鱼肉的质构（硬度与弹性等）、感官及食用品质，肌原纤维内的不易流动水向外部流失，说明肌肉的持水能力变差，咀嚼性变差，品质逐渐下降[34]。从3组图可知，流化冰处理组的大目金枪鱼鱼肉在贮藏过程中不易流动水含量始终大于碎冰组和冷藏组，水分流动性和自由水比例低于其它两组，肌肉持水性较好，这与质构特性的结果相一致。

图6 不同冷藏处理对大目金枪鱼弛豫时间T22、峰面积A22与A23的影响Fig.6 Effect of different refrigerated treatments on T22，A22 and A23 of big-eye tuna

2.9 相关性分析

由表4可看出，大目金枪鱼菌落总数与ATP关联产物IMP、Hx含量、水分迁移及酶活显著相关，其中，自由水A23的增加导致微生物快速繁殖，而后期微生物的生长繁殖增加了酸性磷酸酶活性，使IMP降解及Hx积累速率加快，促进鱼体腐败。ATP降解产物相关值间极显著，且与菌落总数、TVB-N显著相关，表明其可用于大目金枪鱼冷藏过程中鲜度变化的评价。同时，TVB-N值与电导率、质构（弹性、硬度、咀嚼性）显著相关，主要是由于肌肉肌原纤维蛋白降解为小分子胺类物质使细胞浸出液导电能力增强，肌肉结缔组织被破坏，质地变得松软。此外，质构特性的变化与肌原纤维内不易流动水的损失也有密切关系。

表4 不同冷藏处理的大目金枪鱼各指标间相关性分析Fig.4 Correlation analysis between different indexes of large-eye tuna under different refrigerated treatments

3 结论

随着贮藏时间的延长，不同冷藏处理条件下的大目金枪鱼电导率、TVB-N值、菌落总数对数值、自由水T23、鲜度值（K值、Ki值、P值及H值）显著上升，且流化冰处理金枪鱼的参数均低于冷藏对照组和碎冰处理组。同时，样品的硬度、弹性、咀嚼性、不易流动水T22及Fr值等显著下降，流化冰处理组测定指标结果明显优于另外两组。结果表明，流化冰处理相比于碎冰和冷藏组可更好地保持水产品的营养和口感，控制肌原纤维内部水分的流失，提高肉品保水性，从而达到更好的保鲜和延长货架期的效果。此外，随着贮藏时间延长，ATP关联产物中的AMP和ADP含量变化较小，ATP与IMP含量逐渐降低，Hx含量逐渐增加，HxR含量呈先升后降趋势。ACP与ADA活性的变化在贮藏前期无明显规律，在贮藏后期呈升高趋势，ACP活性与菌落总数等显著相关。流化冰处理的金枪鱼样品的酶活低于其它两组，说明流化冰可通过抑制ATP关联酶活性和微生物增长来抑制营养物质的降解和ATP关联产物的积累，从而达到保鲜效果。