L-抗坏血酸棕榈酸酯对亚麻酸甘油三酯热致异构反式产物动力学的影响

郭 芹 陈 爽，2 郑佳丽，2 李庆鹏 王 强* 哈益明

（1 中国农业科学院农产品加工研究所/农业部农产品加工综合性重点实验室 北京100193

2 北京石油化工学院 北京102617）

亚麻酸（C18：3-9c，12c，15c）是较复杂、绝大多数植物油中含量较高的一类不饱和脂肪酸，在植物油脂中以亚麻酸甘油三酯的形式存在，尤其是西北地区常用的亚麻籽油和紫苏油，其含量达50%~65%，具有降血压、抗癌等作用[1]。植物油在精炼过程中，30%以上的亚麻酸发生异构，生成1%～4%的C18：3-9c，12t，15c、C18：3-9c，12c，15t、C18：3-9t，12c，15c、C18：3-9c，12t，15t、C18：3-9t，12c，15t等反式亚麻酸（TLNAs）[2-3]，在煎、炒、炸等烹饪过程TLNAs含量会持续增加[4-5]。大量摄入TLNAs能够诱发心脑血管疾病特别是增加冠心病的发病率[6]。研究证实TLNAs异构体的摄入量每人每天不超过5～6 mg，其中C18：3-9t，12c，15c和C18：3-9c，12c，15t的摄入各不超过2 mg，C18：3-9c，12t，15c和C18：3-9t，12c，15t的总量摄入不超过2mg[7]，因此，控制热加工过程TLNAs生成极其重要。

L-抗坏血酸棕榈酸酯（L-AP），具脂溶性和食品乳化性，是世界卫生组织和食品添加剂联合委员会认可的一种新型、多功能的食品添加剂。研究表明L-AP具有较好的抗氧化性[8-9]，其抗氧化作用随着添加量的增加而增强[10]。贺凡等[11]研究表明L-AP还具有抗异构作用，其抗异构效果显著高于VE、TBHQ、鼠尾草酸和茶多酚。L-AP如何抑制反式脂肪酸（TFAs）的形成仍待解决。气相色谱（GCFID）是分析食用油脂中TFAs的常用方法，目前推荐使用的强极性氰丙基聚硅氧烷型色谱柱SP-2560、BPX-70、CP-Sil88和HP-88等[12-15]都无法将亚麻酸顺反异构体完全分离，而新的高极性离子液色谱柱能明显提高反式亚麻酸异构体的分离效果[16]。

由于油脂体系复杂，脂肪酸种类繁多，脂肪酸之间相互转化，成为TFAs机理研究的瓶颈。本研究以亚麻酸甘油三酯为研究对象，模拟食用油的热加工，采用高极性离子液气相色谱柱分析L-AP对亚麻酸甘油三酯热致异构反式产物形成动力学的影响，阐明L-AP对反式亚麻酸形成的作用机理，为采取有效措施准确控制TFAs的形成提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

亚麻酸甘油三酯（纯度为99%），Nu-CHEK；亚麻酸甲酯顺反异构体标准品，Sigma-Aldrich；氢氧化钾、丙酮、甲醇，分析纯，国药集团；异辛烷，色谱级，Fisher Scientific；甲基硅油，黏度为500 mm2/s，北京顶业有限公司。

1.2 仪器与设备

分析天平（Scout ProTM/600 g），奥豪斯仪器公司；气相色谱仪（GC-2010），日本岛津公司；高极性离子液色谱柱（SLB-IL111，200m×0.25mm×0.2μm），美国安捷伦科技有限公司；台式高速离心机（Neofuge 15R），力康生物科技有限公司；集热式恒温加热器（DF-101S），予华仪器有限责任公司；漩涡混合仪（QL-901），海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 高温加热方法 准确称取1 g亚麻酸甘油三酯样品于3mL安瓿瓶中，加入0.02%L-AP，以未加0.02%L-AP的样品为对照样（CK），利用氮吹仪将含样品的安瓿瓶通入N2（5mL/min，5min）后，立即用氢火焰熔封机封口，置于200，220，230和240℃的硅油浴中加热2，4，8，12，16，24，32和48 h，加热温度误差控制在±1℃，加热到设定时间，立即取出，室温冷却，于-20℃冰箱保存。

1.3.2 油脂样品的气相色谱检测方法 油脂样品酯化参照Guo等[17]的甲酯化方法。气相色谱的操作参数：SLB-IL111毛细色谱柱的初始温度60℃，保留5min，以20℃/min升温至175℃，保持15min，再以1℃/min的速度升至185℃，保留70 min；进样口温度230℃；色谱柱流量0.6mL/min。氢火焰检测器温度250℃；进样量1μL；分流比60∶1；空气尾吹流量30.0mL/min；氢气流量40 mL/min；空气流量400mL/min；载气，高纯氮。脂肪酸含量的计算方法参照李安等[18]的内标方法计算。

1.3.3 反式亚麻酸异构体的形成动力学研究 亚麻酸甘油三酯热致异构反式产物的形成动力学方程如下：

式中，C——反式产物含量（g/100g）；k——反应速率常数；n——反应级数；t——反应时间（h）。方程（1）积分得（C0到Ct；t=0到t=t）：

该积分公式在n≥2时有效。若反应级数为零级反应（n=0），反式产物浓度与其初始浓度无关，仅与加热温度和加热时间有关，则方程（2）为：

若反应级数为一级反应（n=1），则方程（2）变为：

测定不同加热温度和加热时间反式产物的浓度，拟合曲线。R2值高的被认为是合理的动力学曲线图，用来确定反应级数和计算速率常数。热致异构反应的活化能（Ea）可通过加热温度和反应速率计算。反应速率和反应温度之间的关系可用阿伦尼乌斯公式表示：

式中，A--指前因子；R——理想气体通用常数；Ea——活化能，根据ln k-T-1曲线图计算。当n≥2级，热致异构反式产物浓度、温度和时间数学模型：

零级反应，热致异构反式产物浓度、温度和时间数学模型：

一级反应，热致异构反式产物浓度、温度和时间数学模型：

1.4 数据分析

油脂样品经GC-FID分析，反式异构体含量采用内标法计算。每次试验重复3次，取平均值，用SigmaPlot 10.0（Systat Software Inc.，San Jose，CA，USA）作图。

2 结果与分析

2.1 L-AP对亚麻酸甘油三酯热致异构反式产物的影响

亚麻酸顺反异构体的极性相近，很难将其色谱峰分开。本研究选择一种新的高极性离子液-气相色谱柱分离亚麻酸顺反异构体。由图1a可知，8种亚麻酸顺反异构体的分离度R≥0.9，说明相邻两异构体基本分离，分离效果高于GB/T22507推荐的SP-2560和CP-Sil88色谱柱[12]，也明显优于SP-2380[19]、BPX-70和HP-88色谱柱[20]。Gomez-Cortes等[16]采用100 m的SLB-IL111色谱柱和Delmonte等[21-22]采用100 m及200 m的SLBIL111色谱柱分离亚麻酸顺反异构体的效果都低于本研究的分离效果。

亚麻酸甘油三酯在200~240℃的条件下加热生成5种反式异构体，其中有3种单反式异构体（C18：3-9t，12c，15c、C18：3-9c，12t，15c和C18：3-9c，12c，15t）和2种双反式异构体（C18：3-9t，12c，15t和C18：3-9t，12t，15c）（图1b，1c），且生成的反式异构体含量随着加热温度和时间的增加而增加。L-AP能抑制单反式和双反式异构体的生成，与贺凡等[11]的研究一致。

图1 亚麻酸顺反异构体标品及加入和未加入L-AP亚麻酸甘油三酯在200℃和240℃加热12 h的气相色谱图Fig.1 Chromatogram of linolenic acid cis-trans isomers standards and trilinolenin heated at 200℃and 240℃for 12 h in the absence（CK）and presence of L-AP

2.2 L-AP对单反式异构体形成动力学的影响

C18：3-9t，12c，15c在200℃形成动力学研究表明：零级反应的R2值为0.9742，高于一级反应（0.773）（表1）。加入L-AP，C18：3-9t，12c，15c形成的零级反应和一级反应R2值分别为0.9682和0.7794（表1），说明C18：3-9t，12c，15c的形成反应为零级反应，加入L-AP不影响C18：3-9t，12c，15c的形成反应级数，并且加热温度对反应级数无影响。从图1a可知，C18：3-9t，12c，15c在200~220℃的生成量随着加热时间的增加而增加，而在230~240℃加热12 h后，其生成量呈下降趋势（图中未列出），说明高温长时间加热C18：3-9t，12c，15c的形成速率低于降解速率。在线性范围内，C18：3-9t，12c，15c的形成反应速率（k）为0.2364 g/（100g·h）（200℃）、0.3770 g/（100g·h）（220℃）、0.7771 g/（100g·h）（230℃）和1.0246 g/（100 g·h）（240℃）；在相同的加热温度下L-AP能降低其形成速率，抑制率分别为7.6%，5.6%，10.93%和17.77%（表2）。

加入和未 加入L-AP，C18：3-9c，12t，15c和C18：3-9c，12c，15t形成的零级反应R2值高于一级反应（表1），说明这两种异构体形成的反应为零级反应。在200～220℃加热，C18：3-9c，12t，15c和C18：3-9c，12c，15t的生成量随着加热时间的增加而增加（图1b和图1c），而C18：3-9c，12t，15c在240℃加热16 h和C18：3-9c，12c，15t在230～240℃加热12 h后，由于降解速率大于异构速率，其生成量呈下降趋势（图中未列出）。在线性范围内，这两种异构体的形成速率随加热温度和时间的增加而增加，且L-AP能降低其形成反应速率（表2）。

表1 加入和未加入L-AP形成反式亚麻酸异构体反应级数的相关系数（R2 ）Table1 Correlation coefficients（R2 ）of formed trans linolenic acid isomers in the absence（CK）and presence of L-AP

从表2可知，在200～230℃，亚麻酸甘油三酯加热生成单反式异构体的速率增长较快，温度高于230℃，异构速率的增长较慢，且单反式异构体的形成速率C18：3-9c，12c，15t＞C18：3-9t，12c，15c＞C18：3-9c，12t，15，说明亚麻酸甘油三酯高温加热先形成C18：3-9c，12c，15t，再依次生成C18：3-9t，12c，15c和C18：3-9c，12t，15c。L-AP对这3种异构体的抑制率从大到小依次是C18：3-9c，12c，15t、C18：3-9t，12c，15c和C18：3-9c，12t，15c异构体。以上研究也说明，亚麻酸甘油三酯在高温加热过程中亚麻酸链上15位氢先发生异构，后是9位和12位的氢发生异构；与油脂中的亚油酸甘油三酯的异构一致，先是亚油酸链上的12位氢发生异构，后是9位氢发生异构[17]。也就是说油脂中的这一类多不饱和脂肪酸的热致异构形成单反式异构体的异构位置先发生在离羰基较远双键的碳氢键，再是离羰基最近双键的碳氢键，最后是中间位置的碳氢键。可见，L-AP对油脂中亚麻酸热致异构形成单反式异构体的抑制作用位点优先发生在离羰基较远双键的15位氢上，再是最近双键的9位氢上，最后是12位的氢上。

从图2d-2f可知，C18：3-9t，12c，15c、C18：3-9c，12t，15c和C18：3-9c，12c，15t的ln k与1/T的线性关系较好（R2＞0.92），根据图中曲线计算的活化能如表2所示，这3种异构体的活化能分别为68.87，95.41，68.77 kJ/mol，这也解释了C18：3-9c，12c，15t的生成量高于C18：3-9t，12c，15c和C18：3-9c，12t，15c，是因为形成C18：3-9c，12c，15t所要跨越的能垒低于C18：3-9t，12c，15c和C18：3-9c，12t，15c。加入L-AP后，形成这3种单反式异构体的活化能增加，所要跨越的能垒也增加，生成单反式异构体更难。

2.3 L-AP对双反式异构体形成动力学的影响

加入和未加入L-AP，亚麻酸甘油三酯加热形成C18：3-9t，12c，15t和C18：3-9t，12t，15c的零级反应R2值大于一级反应，说明C18：3-9t，12c，15t和C18：3-9t，12t，15c的形成反应为零级反应（表1）。从图3a可知，C18：3-9t，12c，15t在200℃～240℃的生成量随着加热时间的增加而增加，而在200℃加热8 h无C18：3-9t，12c，15t生成。在240℃加热28 h后C18：3-9t，12c，15t的生成量呈下降趋势（图中未列出）。从图3b可知，亚麻酸甘油三酯在200℃和220℃加热16 h，230℃加热12 h，240℃加热4 h无C18：3-9t，12t，15c生成。在240℃加热28 h后C18：3-9t，12c，15t的生成量呈下降趋势（图中未列出）。在线性范围内，C18：3-9t，12c，15t和C18：3-9t，12t，15c的形成反应速率随着加热温度和时间的增加而增加，L-AP能降低C18：3-9t，12c，15t和C18：3-9t，12t，15c异构体的形成速率（表2）。

图2 未加和加入L-AP亚麻酸甘油三酯热致异构单反式异构体浓度与时间的关系图以及单反式异构体ln k与1/T图Fig.2 Plots showing the correlation between thermally induced single trans isomers concentrations of trilinolenin and time，and the relationship between ln k and 1/T for single trans isomers in the absence（CK）and presence of L-AP

由表1可知，双反式异构体的形成速率明显低于单反式异构体的形成速率，再次证明亚麻酸甘油三酯热致异构先形成单反式异构体，后形成双反式异构体。双反式C18：3-9t，12c，15t形成速率明显高于C18：3-9t，12t，15c的形成速率，说明单反式异构体在加热过程中先形成双反式C18：3-9t，12c，15t，再形成双反式C18：3-9t，12t，15c。根据单反式异构体的形成分析可知，亚麻酸甘油三酯中的亚麻酸链上15位和9位的氢比12位的氢更容易发生热致异构，说明双反式C18：3-9t，12c，15t异构体主要由单反式C18：3-9t，12c，15c和C18：3-9c，12c，15t异构生成，C18：3-9t，12t，15c异构体主要由单反式C18：3-9t，12c，15c和C18：3-9c，12t，15c异构生成。

表2 L-AP对亚麻酸甘油三酯热致异构反式产物形成动力学参数的影响Table2 Effects of L-AP on the kinetic parameters of thermally induced trans products of trilinolenin

图3 未加和加入L-AP亚麻酸甘油三酯热致异构双反式异构体浓度与加热时间的关系图以及双反式异构体ln k与1/T图Fig.3 Plots showing the correlation between thermally induced double trans isomers concentrations of trilinolenin and heating time，and the relationship between ln k and 1/T for double trans isomers in the absence（CK）and presence of L-AP

L-AP对亚麻酸甘油三酯在200℃加热生成的双反式C18：3-9t，12c，15t的抑制率为6.3%，明显低于同温度下单反式C18：3-9c，12c，15t（7.8%）、C18：3-9c，12t，15c（9.8%）和C18：3-9t，12c，15c（7.6%）的抑制率。L-AP对亚麻酸甘油三酯在240℃加热生成的双反式C18：3-9t，12c，15t和C18：3-9t，12t，15c的抑制率分别为16%和9.38%，也低于同温度下单反式C18：3-9c，12c，15t（16.3%）、C18：3-9c，12t，15c（16.56%）和C18：3-9t，12c，15c（17.77%）的抑制率。以上说明L-AP对亚麻酸甘油三酯热致异构反式产物的抑制作用主要是通过抑制单反式异构体的形成来降低反式亚麻酸的生成。

从图3c和3d可知，C18：3-9t，12c，15t和C18：3-9t，12t，15c的ln k与1/T图的线性关系较好（R2＞0.93）。虽然形成双反式C18：3-9t，12c，15t所要跨越的能垒（160.44 kJmo/l）高于形成C18：3-9t，12t，15c所要跨越的能垒（143.88 kJ/mol），但双反式C18：3-9t，12c，15t的形成速率更快，C18：3-9t，12c，15t的生成量高于C18：3-9t，12t，15c的生成量。从表2可知，形成双反式异构体的活化能明显高于形成单反式异构体的活化能，说明形成双反式异构体更困难。加入L-AP后，形成双反式异构体的活化能增加，其增加量明显低于形成单反式异构体活化能的增加量，再次说明L-AP的抑制作用位置主要是抑制单反式异构体的形成。根据表2中的速率常数和活化能建立了亚麻酸甘油三酯热致异构反式产物浓度与加热温度和时间的预测模型，根据加热温度和时间来预测各反式异构体浓度。

表3 未加和加入L-AP亚麻酸甘油三酯热致异构反式产物浓度与加热时间和温度的数学模型Table3 The mathematical model of thermally induced trans products concentration of trilinolenin，heating time and temperature in the absence（CK）and presence of L-AP

3 结论

采用200m高极性离子液毛细管色谱柱对8种亚麻酸顺反异构体进行有效分离。3种反式和2种双反式异构体的形成反应属于零级反应，形成反应速率随加热温度和时间的增加而增加，并证实亚麻酸甘油三酯热致异构先生成单反式异构体，后生成双反式异构体。L-AP不会改变单反式和双反式异构体的形成反应级数，能明显降低反式异构体的形成速率，其主要作用位置是抑制单反式异构体的形成，主要作用位点是先阻止亚麻酸甘油三酯中亚麻酸链上15位氢发生异构，后是9位和12位的氢发生异构。此外，建立了L-AP存在条件下反式亚麻酸浓度与加热温度和时间的预测模型。