银离子固相萃取法测定反刍动物反式脂肪酸异构体含量

胡盛本 蔡澄亮 卓成飞 周若琳 陶 林 邓泽元 李 静

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室 南昌330047）

膳食反式脂肪酸与人体健康的关系近年来备受关注，而反式脂肪酸的来源主要有两类：一类是植物油或鱼油经高温或者化学催化等过程中产生的大量的反式脂肪酸，被称为工业氢化油反式脂肪酸（industrial trans fatty acids，ITFA）[1-2]，另一类是反刍动物反式脂肪酸（ruminant trans fatty acids，RTFA），这是一类天然的反式脂肪酸，在反刍动物（如牛、羊）瘤胃中，微生物将食物中的多不饱和脂肪酸转化成反式脂肪酸[3-5]。

研究表明，ITFA与心血管疾病的发生呈正相关，摄入过量的ITFA会提高血脂含量，提高体内低密度脂蛋白酯（LDL），降低高密度脂蛋白酯（HDL），同时还会提高脂蛋白含量，如提高载脂蛋白A1等[6-8]。有研究发现ITFA可提高细胞内炎症因子ICAM～1,VCAM～1的表达，从而促发炎症[9-10]。目前对反刍动物反式脂肪酸与人类健康的关系仍有争议，一方面有研究称，与ITFA和RTFA一样，能提高血脂含量，促发功能紊乱，要求在食品标签上标注反刍动物反式脂肪酸的含量；另一部分研究则认为反刍动物反式脂肪酸能改善血脂，对血管健康有益。

反式十八碳一烯酸（Trans octadecenoic acid，trans-18：1）是反刍动物脂质中起主导性的一类脂肪酸，而不同的反式十八碳烯酸对健康的影响也不同，11t18：1是反刍动物中含量最高的一类反式脂肪酸，有报道称其可以预防癌症的发生[11]，而9t18：1会使得血脂异常，诱导心血管疾病发生[12]。此外，反刍动物脂质中还含有9t16：1。有研究称，除了反刍动物自身含有9t16：1外，还有部分是通过11t18：1氧化生成，9t16：1能够提高胰岛素的敏感性，对糖尿病的促发有一定抑制作用，还能舒缓血管压力[13-15]。作者推测，反式脂肪酸异构体的种类及含量的不同，可能是造成这种争议的原因。了解反刍动物反式脂肪酸异构体的种类、含量，对于揭示RTFA与人类健康的关系有一定的指导意义。

目前分离反式脂肪酸的方法主要有两种：一种是银离子薄层色谱法[16]，另一种是银离子固相萃取法[17-18]，其原理是银离子与不饱和脂肪酸双键间有微弱作用力，其强度随双键数目的增加而增加，随键长的增加而减弱，特别是银离子与顺式异构体的结合比反式异构体更为牢固。而银离子薄层色谱操作复杂，耗时较长，且损失率比较大；反之，银离子固相萃取法，步骤简单，损失率低。

利用银离子固相萃取法从反刍动物脂质中分离出反式脂肪酸异构体，用气相色谱仪检测3种反刍动物脂质甘油三酯和磷脂反式脂肪酸异构体的种类与含量，并以氢化大豆油作为对照，为揭示RTFA对健康的影响提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原材料：牛奶、牛肉、羊肉。

试剂：脂肪酸标准品（GLC463标样），NuChek．Prep公司；氯仿、甲醇、草酸、乙腈、甲醇钠、异丙醇等均为分析纯试剂；乙酸乙酯、正己烷为色谱纯试剂。

仪器与设备：FA2204B电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；6890N型气相色谱仪，美国安捷伦公司；TDL～5～A低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；DF101B数显集热式搅拌器，金坛市大地自动化仪器厂；

1.2 试验方法

1.2.1 样品预处理 样品从超市购买，其中，牛奶4℃保存。洗净牛肉和羊肉，搅碎后4℃保存。

1.2.2 样品脂质的提取 参照Folch法[19]并作修改，提取原料中的脂质。分别取1 g牛肉、羊肉或1mL牛奶放入50mL大试管中，加入2mL水，5 mL甲醇和2.5mL氯仿，震荡1～2min，加入2.5 mL水和2.5mL氯仿，涡流混匀，离心，取下层有机相，用氮气吹干，得到粗油脂。

1.2.3 甘油三酯和磷脂的分离和收集 用氨丙基硅胶固相萃取小柱对油脂样品进行纯化[20-21]。用前先用7.5mL正己烷对固相萃取小柱进行除杂，然后取适量样品溶解于0.2mL氯仿中，上样。用4 mL氯仿-异丙醇（2∶1）洗脱出中性脂质甘油三酯，用4mL乙醚-乙酸（98∶2）洗脱出游离脂肪酸，最后用4mL甲醇洗脱出磷脂，收集洗脱出的甘油三酯和磷脂，氮气吹干，-20℃下保存。用TLC法确定分离效果是否良好。

1.2.4 脂肪酸的测定

1.2.4.1 总脂肪酸和甘油三酯脂肪酸的测定 总脂肪酸和甘油三酯脂肪酸的测定采用碱法甲酯化方法[22]。取2mg TAG溶于1.5mL正己烷，加入40μL乙酸甲酯和100μL（0.5mol/L）甲醇钠溶液，涡流混匀1min，37℃下反应20min，置于冰箱下层-20℃冷冻10min，取出后立即加入100μL草酸溶液，离心弃沉淀，N2吹干，GC分析TAG脂肪酸组成。

1.2.4.2 磷脂脂肪酸的测定 磷脂脂肪酸的测定采用酸法甲酯化方法。称取2mg磷脂于15mL试管中，分别加入2mL 14%三氟化硼～甲醇溶液，1 mL甲苯，冲入氮气，密封，90℃水浴加热1 h,冷却至室温，加入3mL正己烷和1mL超纯水，涡流混匀，2 000 r/min离心10 min，取2mL上清液，氮气吹干，加入1mL正己烷（色谱纯）复溶，转移至进样瓶，GC测定。

1.2.5 银离子固相萃取柱分离反式脂肪酸[23]按照1.2.4节方法得到脂肪酸甲酯，用银离子固相萃取柱（750mg/6mL）分离出反式十八碳烯酸甲酯，先分别用4mL丙酮和4mL正己烷活化柱子，将1～2mg脂肪酸甲酯溶于1mL正己烷，上样，之后用6mL正己烷（99∶1，V/V）洗脱出饱和脂肪酸甲酯，再用6mL正己烷-丙酮（96∶4，V/V）洗脱出反式十八碳烯酸甲酯。

1.2.6 气相色谱分析 色谱条件参照Cruz～Hernandez等[24]，色谱柱为CP～Sil88熔融石英毛细管柱（100m×0.25mm×0.2μm）。载气为H2，燃烧气为H2、N2和空气。FID温度250℃，进样口温度250℃。气相色谱程序：45℃时保持4min，以13℃/min的速率将温度升至175℃，保持27min，再以4℃/min的速率升至215℃，保持35min。脂肪酸的分析参照标准图谱，脂肪酸含量采用面积归一化法确定（以峰值面积的百分比表示）。

1.2.7 数据分析 用SPSS20.0分析数据，结果用Mean±SD表示。用Excel分析处理数据，所有试验均重复3次以上。用单因素方差分析比较均值，P＜0.05为显著差异。用Origin8.0绘图，用Metabonalyst 3.0进行最小偏二乘法分析和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 反刍动物脂质各组分含量

图1显示3种反刍动物脂质中各组分含量。反刍动物中，TAG含量占总脂质含量的58.25%～66.13%，其中含量最高的是牛奶TAG，占总脂质的66.13%，最低的是牛肉TAG，占总脂质的58.25%。PL含量占总脂质含量的12.22%～17.09%，含量最高的是羊肉PL，占17.09%，最低的是牛肉TG，占12.22%。在氢化大豆油中，甘油三酯占总脂的92.65%，磷脂未洗脱出来，这可能是油脂在精炼过程中，经脱酸、脱色和脱臭等步骤去除了磷脂。

图1 反刍动物各脂质组分含量Fig.1 Lipids classes in ruminant animals oil

2.2 反刍动物各脂质组分中反式脂肪酸含量

图2a显示3种反刍动物脂质和氢化大豆油总脂肪酸含量。在牛奶脂质、牛肉脂质和羊肉脂质中，反式脂肪酸含量最高的是羊肉脂质，占总脂肪酸的7.64%，其次为牛奶脂质，占总脂肪酸的3.05%，含量最低的是牛肉脂质，占总脂肪酸的2.77%。此外，在3种反刍动物脂质中共检测出3类反式脂肪酸：trans-16：1、trans-18：1和trans-18：2，其中总反式脂肪酸含量最高的是羊肉脂质，占总脂肪酸的7.64%，其次为牛奶脂质，占总脂肪酸的3.05%，含量最低的是牛肉脂质，占总脂肪酸的2.77%。含量最高的反式脂肪酸是trans-18：1，分别占总脂肪酸的2.18%～6.69%。而氢化油中，反式脂肪酸含量高达45.43%。共检测出两类反式脂肪酸：trans-18：1和trans-18：2，最主要的反式脂肪酸是trans-18：1，占总脂肪酸的45.13%。

图2b显示反刍动物脂质甘油三酯脂肪酸含量，其中总反式脂肪酸含量最高的是羊肉脂质，占总脂肪酸的7.38%，其次为牛肉脂质，占总脂肪酸的3.09%，含量最低的是牛奶脂质，占总脂肪酸的2.67%。共检出3类反式脂肪酸：trans16：1、trans-18：1和trans18：2，其中含量最高的反式脂肪酸是trans-18：1，分别占总脂肪酸的2.13%～6.42%。氢化油中，反式脂肪酸含量高达44.35%，共检出两类反式脂肪酸：trans-18：1和trans-18：2，最主要的反式脂肪酸是trans-18：1，占总脂肪酸43.40%，占总反式脂肪酸的97.97%。

图2c显示3种反刍动物脂质磷脂反式脂肪酸含量，其中总反式脂肪酸含量最高的是牛肉脂质，占总脂肪酸的5.89%，其次为牛奶脂质，占总脂肪酸的3.15%，含量最低的则是羊肉脂质，占总脂肪酸的2.72%。此外，共检测出3类反式脂肪酸：trans-16：1、trans-18：1和trans-18：2，其中含量最高的反式脂肪酸是trans-18：1，分别占总脂肪酸的1.86%～4.53%。

2.3 反刍动物脂质中trans-18：1异构体含量

表1为反刍动物脂质trans-18：1异构体含量，总脂中，从牛奶和牛肉脂质中检测到8种trans-18：1异构体，而羊肉脂质中检测到9种trans-18：1异构体，其中含量最高的是11t18：1，分别占总反式脂肪酸的30.33%～39.03%，含量最高的为牛奶脂质，占39.03%，最低的为羊肉脂质，占30.33%。而氢化大豆油中，检测出7种trans-18：1异构体，含量最高的是6-8t18：1，它们未能分开，其次是9t18：1，占总反式脂肪酸的21.79%。

甘油三酯，在3种反刍动物脂质中共检出7种trans-18：1异构体含量，其中含量最高的是11t18：1，分别占总反式脂肪酸的38.08%～45.09%，含量最高的为牛奶脂质，占45.09%，最低的为牛肉脂质，占38.08%。氢化大豆油中，检出7种trans-18：1异构体，含量最高的是6-8t18：1，它们未能分开，其次是9t18：1，占总反式脂肪酸的19.91%。

磷脂，在3种反刍动物脂质中，从牛奶和牛肉脂质中检测到8种trans-18：1异构体，而从羊肉脂质中检测到7种trans-18：1异构体，其中含量最高的是11t18：1，分别占总反式脂肪酸的27.10%～44.47%，含量最高的为羊肉脂质，占44.47%，最低的为牛奶脂质，占27.10%。

图2 反刍动物脂质反式脂肪酸含量Fig.2 Fatty acids compositions of ruminant animals lipids

表1 反刍动物脂质trans-18：1异构体含量（占总trans-18：1百分含量）Table1 Trans octadecenoic acid isomers in ruminant animals lipids（percentage of tatal trans-18：1）

（续表1）

2.4 多元统计学分析反刍动物脂质脂肪酸差异

图3显示偏最小二乘法分析反刍动物与氢化大豆油反式脂肪酸差异。由于从反刍动物脂质和氢化油中都分离得到甘油三酯，氢化油中无磷脂，所以甘油三酯是它们共有成分。用甘油三酯反式脂肪酸数据做主成分分析，图3a为总得分图，PC1为91.5%，PC2为7.9%，共含99.4%的信息。可以看出3种反刍动物脂质脂肪酸总得分位于总得分图（图3a）的第二、三象限，而氢化油位于第一、四象限，它们之间间隔很大，说明主成分分析将反刍动物脂质与氢化油脂质区分开。而图3b是VIP score，表明造成这种差异的是一些脂肪酸，其中起主要贡献的脂肪酸有9t18：1，11t18：1和6-8t18：1，这3类反式脂肪酸异构体是反刍动物脂质与氢化大豆油之间的差异反式脂肪酸。此外，总得分图也将3种反刍动物分开，说明它们的反式脂肪酸存在差异，还需进一步分析。

图3 偏最小二乘法分析反刍动物脂质和氢化大豆油反式脂肪酸差异Fig.3 PLS-DA analysis on trans fatty acids of ruminant animal lipids and partially hydrogenated soybean oil

图4显示偏最小二乘法判别分析法（PLSDA）分析反刍动物脂质脂肪酸差异。图4a为总得分图，其中PC1为77.4%，PC2为20.1%，共含97.5%的信息。3种反刍动物脂质脂肪酸总得分分别位于得分图的3个方向，间隔很大，说明PLSDA法分析3种反刍动物脂质反式脂肪酸能将它们区分开。而图4b是VIP score，造成这种差异主要是一些脂肪酸，其中起主要贡献的脂肪酸有PL-11t18：1，PL-15t18：1和TAG-9t18：1等，而这些脂肪酸在这3种反刍动物脂质中含量变化都比较大。

图4 偏最小二乘法分析反刍动物脂质脂肪酸差异Fig.4 PLS-DA analysis on the difference of ruminant animal lipids fatty acids

3 讨论

分析了3种反刍动物脂质反式脂肪酸，并以氢化大豆油反式脂肪酸作对照，发现在氢化大豆油中总反式脂肪酸含量高达45.43%，而反刍脂质中总反式脂肪酸含量仅2.77%～7.64%，氢化油中的反式脂肪酸是反刍动物脂质中的6～16倍。一项元分析表明，每增加2%反式脂肪酸摄入，就会增加23%冠心病的促发率[25]。同时用2%反式脂肪酸的能量取代相对应的碳水化合物、饱和脂肪酸、顺式单不饱和脂肪酸和顺式多不饱和脂肪酸的能量，心血管疾病的发生率会分别增加24%，20%，27%和34%[26]。可见，膳食反式脂肪酸摄入量是造成这两种反式脂肪酸对健康影响的原因之一。

通过比较反刍动物和氢化大豆油反式脂肪酸异构体，发现氢化油中只存在trans-18：1和trans-18：2两类反式脂肪酸，而反刍动物脂质中除此之外还多了一种9t16：1。有研究报道9t16：1有助于缓解2型糖尿病和降低血管压力，减少甘油三酯的产生和提高胰岛素的敏感性[15]。trans-18：1是反刍动物和氢化大豆油中主要的反式脂肪酸，它存在很多同分异构体，通过银离子固相法能够从反刍动物脂质中分离9种trans-18：1异构体，其中甘油三酯中7种，从氢化大豆油总脂质和甘油三酯中分离出7种trans-18：1异构体。反刍动物脂质中，含量最高的trans-18：1是11t18：1，而氢化大豆油中含量最高的是9t18：1。9t18：1被当作工业反式脂肪酸代名词（ITFA），流行病学研究发现它与心血管疾病呈正相关，会造成内皮紊乱，促发炎症和动脉粥样硬化，被认为是一种有害的反式脂肪酸[10，27]。而11t18：1，目前它对健康的影响尚存争议，部分研究发现11t18：1可以部分通过SCD-1脂肪酶转变为CLA，可能是一种有益的脂肪酸，可以降低心血管疾病和癌症的发生[28]。11t-18：1还可以通过β氧化生成9t16：1[14]。反刍动物反式脂肪酸（RTFA）和工业氢化油反式脂肪酸（ITFA）是对健康影响的又一原因，它们在反式脂肪酸异构体含量和种类上存在差异，反刍动物脂质中可能存在更多有益或对健康伤害较小的反式脂肪酸异构体。

通过比较3种反刍动物甘油三酯和磷脂反式脂肪酸，发现在甘油三酯中羊肉中总反式脂肪酸显著高于其它二者（P＜0.05），而在磷脂中是牛肉中的反式脂肪酸含量更高（P＜0.05）。通过PLS-DA分析3种反刍动物反式脂肪酸异构体之间的差异，羊肉脂质中甘油三酯中的9t18：1和磷脂中的11t18：1含量均显著高于牛奶脂质和牛肉脂质（P＜0.05）；牛肉脂质中磷脂中的9t18：1和15t18：1含量均显著高于牛奶脂质和羊肉脂质（P＜0.05）；牛奶脂质磷脂中的12t18：1和16t18：1的含量均显著高于牛肉脂质和羊肉脂质（P＜0.05）。可见，反刍动物脂质磷脂反式脂肪酸的差异显著，这可能是反刍动物物种之间的差异和饲养条件不同所致。对于磷脂上结合的不同反式脂肪酸对人体健康的影响还需进一步的研究。

4 结论

以3种反刍动物脂质为研究对象，以氢化大豆油为对照，测定反刍动物反式脂肪酸种类与含量，并利用银离子固相萃取小柱测定反式十八碳烯酸的种类与含量。研究表明，3种反刍动物脂质之间存在差异，其中甘油三酯和磷脂中总反式脂肪酸含量最高的是羊肉脂质，而磷脂中是牛肉脂质总反式脂肪酸含量最高。通过PLS-DA分析3种反刍动物反式脂肪酸异构体之间的差异，羊肉脂质中甘油三酯中的9t18：1和磷脂中的11t18：1含量均显著高于牛奶脂质和牛肉脂质（P＜0.05）；牛肉脂质中磷脂中的9t18：1和15t18：1含量均显著高于牛奶脂质和羊肉脂质（P＜0.05）；牛奶脂质磷脂中的12t18：1和16t18：1的含量均显著高于牛肉脂质和羊肉脂质（P＜0.05）。这种差异是否是造成RTFA与ITFA对健康的影响差异，还需进一步研究。