植物乳杆菌低脂契达干酪降胆固醇活性的研究

王海霞 曲秀伟 刘 璐 李晓东 张秀秀 赵铭琪

（东北农业大学食品学院 哈尔滨150030）

添加益生菌的干酪除具有营养丰富、质构和风味独特等传统干酪的特性[1]外，还具有自身独有的益生特性，通过筛选特殊功能性的益生菌能开发出具有抗氧化、降胆固醇、降血压等功能性的干酪[2]。近年来，随着消费者膳食营养健康意识的提高，低脂干酪需求增加，相比全脂干酪，降低原料乳脂肪会影响干酪的硬度、弹性、质地及风味，可通过改进工艺来克服这些缺陷。研究发现益生菌作为辅助发酵剂，通过蛋白降解及产生多糖类物质来改善干酪的风味、组织状态及口感[3]。添加脂肪替代物可以改善低脂干酪的品质，例如，菊粉是一类碳水化合物的脂肪替代物，在干酪中模拟乳脂肪来改善低脂干酪的质地、熔化特性及感官特性[4]。

高胆固醇血症会引起冠心病、高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病[5]，降低血清胆固醇可有效防止心血管疾病的发生。目前主要是依靠药物降解血清胆固醇，存在副作用且价格昂贵。通过非药物途径降低血清胆固醇成为研究热点。现有动物和人体试验表明，食用益生菌或其制品有助于降低体内血清胆固醇。ALALIN等[6]研究发现灌喂含嗜酸乳杆菌的酸乳能显著降低小鼠血清TC和LDL-C浓度。Xiao等[7]对年龄在28～60岁的32名成年男性进行研究，发现每天饮用300 g含108CFU/g长双歧杆菌的低脂酸奶4周后，能显著降低中度高胆固醇血症患者（血清总胆固醇＞240 mg/dL）的血清胆固醇水平。目前益生菌体内降胆固醇机制尚未明确。以低脂干酪为载体，在降低脂肪摄入量的同时，如何更好地发挥益生菌体内降胆固醇活性还有待探究。

本实验室工作人员自主分离鉴定出1株具有体外降胆固醇活性及良好的胃、肠道耐受性的植物乳杆菌KLDS 1.0320，将其作为益生菌添加到低脂契达干酪中，选取干酪发酵剂接种量、植物乳杆菌添加量及脂肪替代物菊粉添加量设计单因素试验，结合响应面法优化干酪关键工艺参数；建立高脂动物模型，研究干酪对体内胆固醇的调节作用，为开发新型具有降胆固醇活性的益生菌乳制品提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验动物及饲料：雄性昆明小鼠48只，体质量为（20±2）g，6周龄。高脂饲料：5%蔗糖，1%胆固醇，0.2%胆盐，10%猪油，83.8%基础饲料。

菌株来源：植物乳杆菌KLDS 1.0320由实验室自主分离自内蒙古传统发酵乳制品（前期试验已验证其具有体外降胆固醇活性），保存于东北农业大学乳品重点实验室。

主要试剂：直投式商业发酵剂、凝乳酶Stamix 1150，科汉森公司赠送；菊粉，丰瑞生物科技；MRS固体培养基，上海莼试生物技术有限公司；TC、TG、HDL-C测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。其它试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

BSA124S电子分析天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司；FUT-1800紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；3k15离心机，德国Sigma公司；奶油分离机，广州富一液体分离技术有限公司；。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的活化 根据宋晓辰[8]的方法活化菌种。

1.3.2 植物乳杆菌辅助发酵剂及干酪的制备菌株活化两代，按体积分数2%的接种量接种到60 mL 12%（质量分数）的灭菌脱脂乳中，培养24 h，培养两代至活菌数在109CFU/mL，添加于干酪中。

干酪的制作[9]：原料乳→脂乳（脂肪含量1.0%）→菊粉→巴氏灭菌（63～65℃，30min）→降至34℃→发酵剂及益生菌→氯化钙（0.02%）→凝乳酶（0.003%，1 h）→切割→静置30min→加热搅拌→排乳清→沥干→拌盐（1%）→成型压榨→包装→储藏（4℃），重复3次试验。

干酪水溶性提取液的制备：分别取不同干酪30 g加到90mL生理盐水中，均质2min后，用20~25μm定性滤纸过滤，得到干酪水溶性提取液。

1.3.3 干酪体外降胆固醇作用的测定 干酪样品参照蒋琛等[10]的方法进行胆固醇胶束溶解度抑制率的测定。

1.3.4 感官分析 根据刘丽波[11]的方法并略作改进。采用100分制对成熟24周的干酪进行感官评价，感官评分标准见表1。

表1 感官评价Table1 Sensory evaluation of cheeses

1.3.5 单因素试验 分析发酵剂接种量分别为0.01%，0.02%，0.03%，0.04%和0.05%（质量分数）时胆固醇胶束溶液的溶解度抑制率及感官评分值；分析植物乳杆菌添加量分别为0%，1.0%，1.5%，2.5%和3.0%（体积分数）时胆固醇胶束溶液的溶解度抑制率及感官评分值；分析菊粉添加量分别为0%，0.5%，1.5%，2.5%和3.5%（质量分数）时胆固醇胶束溶液的溶解度抑制率及感官评分值。

1.3.6 响应面设计 以发酵剂接种量、植物乳杆菌添加量、菊粉添加量为自变量，分别记为A、B、C，以成品干酪的感官评分值为响应值，利用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面优化。3个自变量的低、中、高水平以-1，0，1进行编码，试验因素水平设计见表2。

表2 响应面试验设计因素与水平Table2 The factors and levels of response surface experiment design

1.4 降胆固醇动物试验

1.4.1 动物分组及试验方案 昆明系雄性小鼠48只，体重（20±2）g，6周龄。试验前小鼠适应性饲养1周。按体重随机分为4组，每组12只，喂养35 d，分组情况如表3所示。喂养期间，灌胃时间为每天上午9点。

表3 试验小鼠分组及饲养情况Table3 Experimental grouping and feeding mode

1.4.2 体质量、摄食量和饲料利用率的测定 喂养期间，记录小鼠摄食量及体质量，计算饲料利用率。

饲料利用率=体质量增量/摄食量×100%

1.4.3 脏器指数的测定 试验结束，解剖取出小鼠肝脏、脾脏、肾脏，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干后称取重，测定脏器指数。

脏器指数（肝、脾、肾）（%）=内脏质量/小鼠体重×100%

1.4.4 血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C及AI含量的测定 喂养49 d后，根据Akalin等[6]的方法提取小鼠血清，按照试剂盒说明书测定血清TC、TG和HDL-C含量，计算LDL-C及AI。

1.4.5 肝脏及粪便中TC、TG的测定 根据Xie等[12]的方法测定。

1.5 数据处理

用Design Expert 8.0.6软件分析数据，Sigmaplot12.5软件作图。数据统计分析采用Statistix 8.0分析软件（P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著）。每个试验重复3次，结果表示为±SD。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 发酵剂接种量 如图1a所示，增加发酵剂接种量使干酪胆固醇胶束溶解度抑制率降低。其原因在于发酵剂接种量加大使产酸速率加快，干酪中较高的酸度环境抑制植物乳杆菌产生的胆盐水解酶活力[13]。同时，营养物质主要用于发酵剂菌体自身，益生菌能利用的营养成分减少，不利于保持活性[3]。如图1b所示，感官评分值先升高后降低，在接种量为0.02%时最高。发酵剂接种量较低的菌株活力差，产酸速度较慢，发酵时间延长，蛋白分解能力也较差，影响干酪品质[14]。接种量过高使预发酵的整个脱脂乳体系酸度不断加大，pH值降低，逐渐接近酪蛋白的等电点4.6，酪蛋白凝结聚集形成凝乳块，导致干酪质地坚硬[15]。综合对降胆固醇作用的影响，选取质量分数0.02%的直投式商业发酵剂作为响应面中心试验点。

图1 发酵剂接种量对干酪降胆固醇活性及感官评分的影响Fig.1 Effect of inoculation amount of starter on cholesterol-lowering activity and sensory score

图2 植物乳杆菌添加量对干酪降胆固醇活性及感官评分的影响Fig.2 Effect of inoculum amount of Lactobacillus plantarum on cholesterol-lowering activity and sensory score

2.1.2 植物乳杆菌的添加量 如图2a可知，增加植物乳杆菌添加量，干酪胆固醇降解活性增加，当添加量大于1.5%（体积分数）时，胆固醇降解能力变化不显著。植物乳杆菌添加量过多，产酸速率加快，干酪较高的酸度环境会抑制菌株的生长，而菌株活性直接影响其对胆固醇的吸收和降解[13]。如图2b所示，干酪感官评分值先升高后降低，当植物乳杆菌添加量为1.5%（体积分数）时感官评分最高。植物乳杆菌接种量较小，乳酸乳球菌在干酪成熟中起主要作用，益生菌水解蛋白质产生的风味化合物缺乏，而且产生的胞外多糖较少，不利于改善干酪的质地[16]。植物乳杆菌接种量过量，初期发酵过快，产酸造成大量乳清析出，干酪的组织状态变差，且风味物质也缺乏[3]，感官评分值下降。最终选植物乳杆菌1.5%（体积分数）的添加量为响应面中心试验点。

2.1.3 菊粉添加量 由图3a可知，增加菊粉添加量，干酪降胆固醇活性先增加后降低，菊粉添加量为1.5%的干酪在成熟期两个月时达到最大，且成熟过程中降幅最小，成熟24周时高于其它各组（P＜0.05），达51.12%，说明1.5%菊粉能够显著增加干酪的降胆固醇活性。如图3b所示，感官评分值先增加后降低，在菊粉添加量为1.5%（质量分数）时最高。菊粉是一种能产生奶油状的润滑感和黏稠度的多糖，截留的水分可在质感和口感上模拟脂肪[17]，其作为脂肪替代物能够改善低脂干酪品质，同时维持益生菌活性，进一步促进蛋白质分解；而过量菊粉与酪蛋白紧密结合，反而不利于酪蛋白水解产生风味物质，这与Lee M R等[18]的结论相一致。最终选菊粉添加量为1.5%（质量分数）为响应面中心试验点。

图3 菊粉添加量对干酪降胆固醇活性及感官评分的影响Fig.3 Effect of inoculum amount of inulin on cholesterol-lowering activity sensory score

2.2 响应面优化工艺的结果分析

以单因素试验为基础，根据Box-Behnken原则进行响应面分析，试验结果见表4所示。对数据进行多元二次回归拟合，建立工艺参数回归模型，得到回归方程为：

Y=85.6+0.75A+6B+1.25C+0.5AB+3AC-0.5BC-4.8A2-3.3B2-5.8C2

表4 响应面试验设计和结果Table4 Design and result of Response surface test

由表5可知，回归模型的F值为82.64，P＜0.0001，说明模型达到极显著水平；失拟项P=0.0649＞0.05，说明失拟项差异不显著，试验无失拟因素，可充分反映实际情况。试验模型的决定系数R2=0.9907，试验值与预测值较接近，说明该回归模型合理，能较好地解释响应值。同时，从F检验可判断出各因素对干酪工艺影响的顺序为植物乳杆菌添加量（B）＞和菊粉添加量（C）＞发酵剂接种量（A）。从回归方程及方差分析能够看出，模型中一次项B对工艺的影响达到极显著水平（P＜0.0001），C对工艺的影响达到显著水平（P＜0.05）；二次项A2、C2对工艺的影响为极显著水平（P＜0.0001）；交互项AC对工艺的影响为显著水平（P＜0.05）。

表5 回归方程系数显著性Table5 Significance coefficient of Regression equation

2.3 响应面分析

由统计分析软件并依据回归方程，得到3个单因素间响应面及等高线，结果如图4～6所示。

由响应面图形可看出最佳参数及各因素间的相互作用，根据响应面等高线图可以看出极值出现在圆心处，说明在所选范围内可得到响应值的最大值[19]。通过以上结果分析A，B，C三因素，得到最优条件是：发酵剂接种量0.02%（质量分数），植物乳杆菌添加量1.94%（体积分数），菊粉添加量2.00%（质量分数），用此配方制作的干酪感官评分值为87.36。为便于操作，将植物乳杆菌添加量修正为体积分数2.00%。为检验此响应面法所得结果的可靠性，按照上述修正的条件，制作5组干酪并进行感官评分，得到平均值为86.78，和理论预测值吻合，说明该响应面结果可靠。

图4 Y=f（A，B，0）的响应面及等高线Fig.4 Response surface and contour lines for Y=（A，B，0）

图5 Y=f（0，B，C）的响应面及等高线Fig.5 Response surface and contour lines for Y=（0，B，C）

图6 Y=f（A，0，C）的响应面及等高线Fig.6 Response surface and contour lines for Y=（A，0，C）

2.4 益生菌干酪体内降胆固醇活性分析

2.4.1 体质量、摄食量、饲料利用率及脏器指数如表6所示，饲喂高脂饲料的3组的小鼠体质量增重、摄食量和饲料利用率明显低于A组小鼠，这可能是由于高脂饲料导致小鼠胆固醇升高等一系列的机体反应，并导致大鼠食欲下降。4组小鼠的肝脏质量发生明显的变化（P＜0.05），饲喂普通饲料的小鼠质量显著高于饲喂高脂饲料的3组，初步反映小鼠食入过多的胆固醇会蓄积在肝脏，对肝脏产生影响。D组小鼠的肝重指数显著低于高脂B组，说明益生菌干酪在小鼠体内发挥了作用，降低了脏器上胆固醇的存积量，减轻了脏器负担。

2.4.2 血脂 研究表明，TC、TG和LDL-C是导致动脉硬化的直接因素；HDL-C可以作为动脉硬化的保护因素；动脉硬化指数AI是国际医学界制定的一个衡量动脉硬化程度的指标，指数越高，表明患病程度越高[20]。

表6 小鼠的体重、摄食量和饲料利用率Table6 Body weight，total food intake and food efficiency of rats

表7 低脂干酪对小鼠脏器指数的影响Table7 Effect of low-fat Cheddar cheese on organ indexes

表8 低脂干酪对小鼠血脂的影响Table8 Effect of low-fat Cheddar cheese on serum TC，TG，LDL-C and HDL-C

由表8可知，3组高脂饲料组的TC、TG和LDL-C水平显著高于普通饲料A组（P＜0.05），HDL-C水平显著低于普通饲料A组（P＜0.05），表明小鼠己患上高脂血症，高脂模型建立成功。35 d灌胃试验后，与B组相比，D组的TC、TG和LDL-C含量均得到显著抑制（P＜0.05），分别下降了21.23%，25.57%和39.11%，且显著低于空白对照C组（P＜0.05），说明该组干酪能降低小鼠血清中TC、TG和LDL-C含量；血清HDL-C虽相比B组略有升高，但差异不显著（P＞0.05）。EIGAWAD等[21]发现，添加乳双歧杆菌和长双歧杆菌的水牛奶酸乳和豆奶能降低高脂小鼠血清及肝脏中TC和LDL-C含量，而对HDL-C含量影响不显著，与本试验结论一致。高脂饲料的B、C、D组AI显著高于A组（P＜0.05），D组AI值较B组下降35.05%，说明高脂饲料增加了小鼠的动脉硬化的风险，益生菌干酪发挥一定的调节功效。这可能是由于植物乳杆菌具有降胆固醇活性，同时菊粉作为益生元能进一步刺激其在肠道内增殖，从而更好地发挥降胆固醇作用[22]。还有学者发现益生菌能将菊粉分解成具有降低血清胆固醇的短链脂肪酸，从而对高脂血症引起的动脉硬化具有更好的功效[23]。

2.4.3 益生菌干酪对小鼠肝脏和粪便中TC和TG的影响 测定4组小鼠肝脏TC、TG含量和粪便TC、TG含量，以了解胆固醇在小鼠体内的积存和排除情况，从而得知高脂饮食中的胆固醇在动物体内的去向。

表9 低脂干酪对小鼠肝脏和粪便中TC和TG质量分数的影响Table9 Effect of low-fat Cheddar cheese on the liver and fecal cholesterol levels in rats

由表9可知，D组小鼠肝脏中的TC、TG相比于B组分别下降了37.32%和17.33%，显著低于灌胃空白低脂干酪的小鼠（P＜0.05），说明益生菌干酪对高脂小鼠肝脏胆固醇有明显的降低作用，能减少胆固醇在肝脏的积存。Fukushima等[22]研究发现给高脂模型的大鼠饲喂嗜酸乳杆菌发酵的米糠后，降低了大鼠肝脏中胆固醇合成限速酶（HMG-CoA）的活性，进而降低由高脂饮食导致的肝脏中血脂水平的升高。也有研究发现某些益生菌发酵益生元产生的丁酸盐，能够抑制胆固醇在肝脏中的合成，产生的丙酸盐通过抑制脂肪酸在肝脏中的合成来减少甘油三醋的分泌，发挥体内降胆固醇作用[22]。D组小鼠粪便中TC和TG比B组分别升高37.2%和30.66%（P＜0.05），说明益生菌干酪使饮食来源的无法被吸收利用的胆固醇排出体外。Jeun J等[24]研究表明益生菌有助于增加粪便胆汁酸的排泄，从而有利于调节肝脏胆固醇水平的平衡。也有研究发现双歧杆菌和乳杆菌对结合型胆汁酸有脱饱和作用，将胆固醇还原为粪胆固醇来发挥降胆固醇作用[25]。

3 结论

本研究优化得出：在发酵剂接种量为0.02%（质量分数），植物乳杆菌添加量为2.00%（体积分数），菊粉添加量为2.00%（质量分数）时低脂干酪易被接受，且感官评分值最高。灌胃试验组干酪小鼠的TC、TG、LDL-C及AI比高脂模型组分别下降21.23%，25.57%，39.11%和35.05%，说明该干酪具有一定调节血脂，降低体内胆固醇的作用。小鼠肝脏中TG和TC下降，粪便中TG和TC升高，表明干酪降胆固醇作用可能与植物乳杆菌及菊粉促使体内胆固醇的合成减少或代谢加速有关。关于益生菌及其发酵乳制品降胆固醇的作用机制尚未明确，还有待进一步研究。