姜黄素通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β轴对低氧性肺动脉高压的干预作用

蔡学定，陈马云，李文雅，吴佩亮，姚丹，黄晓颖

（温州医科大学附属第一医院 呼吸与危重症医学科，浙江 温州 325015）

肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）是一种以肺血管收缩与结构重塑为特征的慢性进展性疾病，病死率高[1]。肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）的异常增殖是肺血管结构重塑的主要原因，而多种炎症反应参与其中[2-3]。目前已有研究探明姜黄素可通过Nod样受体蛋白3（Nod-like receptor protein 3， NLRP3）炎性体相关通路调节炎症反应[4]。姜黄素是否在低氧性肺动脉高压（hypoxia induced pulmonary hypertension，HPH）疾病模型中通过NLRP3炎性体相关通路抑制炎症反应从而抑制HPH未见报道。本研究通过建立HPH大鼠模型和低氧PASMCs模型，探讨姜黄素通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β轴对HPH的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF级健康雄性SD大鼠，购于上海斯莱克公司，体质量200～300 g，动物模型实验在温州医科大学实验动物中心进行，实验动物许可证号：SYXK（浙）2019-0009。DMEM高糖培养基、0.25% EDTA胰酶、胎牛血清、青/链霉素购于美国Gibco公司。RIPA裂解缓冲液、BCA蛋白定量检测试剂盒、蛋白酶磷酸酶抑制剂、ECL超敏化学发光底物购于美国Thermo Pierce公司。姜黄素单体购于德国Merck公司。兔源性NLRP3抗体、兔源性Caspase-1抗体、兔源性IL-1β抗体购于英国Abcam公司。

1.2 动物分组及造模 将18只SD大鼠随机分为3组（每组6只）：常氧组（N）、低氧组（H）、低氧+姜黄素组（HC）。N组大鼠均置于SPF环境中；H组大鼠造模时被放置于密封的低氧舱内，通过动态充入N2使舱内的O2浓度保持在9%～11%，在自动控制器的作用下将湿度维持在55%～65%，CO2控制在2%以下，低氧造模低氧时间为每日8 h，共造模4周。HC组大鼠进入低氧舱造模前，腹腔注射40 mg/kg姜黄素，N组、H组均腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液。每日密切关注SD大鼠活动情况、饮食情况、精神状态[5]。

1.3 细胞分离培养及分组造模 取SD大鼠，消毒及麻醉后在超净台内取得肺组织，分离出肺细小动脉，去除内皮细胞后剪碎，用含有1 mL 0.2%胶原酶I消化，待肺小动脉碎块消化为絮状物后离心，去上层胶原酶后加入培养基放置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养。3 d后得到原代PASMCs，将细胞传代至 4～6代时收集细胞用于实验。细胞饥饿12 h使细胞周期同步化，之后进行干预。分为N组、H组、HC组（姜黄素浓度为10 μg/mL）。N组培养条件：37 ℃，5% CO2，21% O2，74% N2；H组培养条件：37 ℃，5% CO2，5% O2，90% N2；HC组培养条件：37 ℃，5% CO2，5% O2，90% N2，姜黄素（10 μg/mL）。3组培养时间均为24 h。

1.4 CCK-8法检测细胞活性 将PASMCs制成单细胞悬液并接种至96孔板中，恒温培养箱培养24 h。分组方式同前，每组6个孔，周边设无细胞的空白组，分别置入相应培养箱进行培养。干预结束后，倒去培养液，每孔中加入培养基和CCK-8试剂，迅速避光放入培养箱中，1～2 h后快速放入酶标仪中进行检测，设置酶标仪检测波长450 nm，测量各孔的吸光度（absorbance，A）。

1.5 肺动脉压力测定及右心肥大指标检测 用20%乌拉坦腹腔注射麻醉SD大鼠，固定大鼠后分离右颈外静脉，测压管插管至肺动脉，生理记录仪测得每只大鼠平均肺动脉压（mean pulmonary artery pressure，mPAP）[6]。大鼠放血处死，取出完整心脏，完整分离右心室（right ventricle，RV）、左心室和室间隔（left ventricle+septum，LV+S），吸干水分后称重，记录并计算右心肥厚指数=[RV/（LV+S）]，反映右心肥大情况。

1.6 肺血管结构重塑指标检测 取大鼠右肺上叶放入4%多聚甲醛中固定24 h，肺组织常规石蜡包埋切片，行HE染色。制作好的HE染色切片在普通光学显微镜下观察，随机选取6个不同视野下的肺中小动脉拍照。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析肺中小动脉管壁面积/管总面积（wall area to total area，WA/TA）以反映肺血管结构重塑的程度。

1.7 Western blot检测NLRP3、Caspase-1、IL-1β相关蛋白表达 提取各组大鼠肺组织标本和PASMCs总蛋白，测定总蛋白浓度。取细胞蛋白样品40 μg、组织蛋白样品60 μg分别行凝胶电泳，转膜至PVDF膜后，脱脂牛奶封闭，4 ℃孵育一抗过夜。次日清洗后孵育二抗，漂洗后运行成像仪进行曝光。使用Quantity One测定各条带的灰度值，以GAPDH为内参，各组目的蛋白与对应GAPDH灰度值的比值即为该组蛋白的相对表达量，比较各组蛋白的表达差异。

1.8 统计学处理方法 采用SPSS21.0统计软件进行分析。计数资料用表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组PASMCs数量比较 与N组（1.079±0.039）比，H组（1.326±0.060）PASMCs数量显著增加，差异 有统计学意义（P＜0.05）；与H组比，HC组（1.158± 0.050）PASMCs数量显著减少，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与N组比，HC组PASMCs数量差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 3组大鼠mPAP、右心肥大程度比较 与N组比，H组大鼠mPAP显著升高，右心肥大指数明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与H组比，HC组大鼠mPAP明显下降，右心肥大指数明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与N组比，HC组mPAP、右心肥大指数差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 3组大鼠mPAP和右心肥大程度比较（每组6只，

表1 3组大鼠mPAP和右心肥大程度比较（每组6只，

与N组比：aP＜0.05；与H组比：bP＜0.05

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2.3 3 组大鼠肺血管重塑程度的比较 与N 组（0.493±0.018）比，H组大鼠WA/TA（0.789±0.042）明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与H组比，HC组大鼠WA/TA（0.652±0.034）明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与N组比，HC组大鼠WA/TA差异有统计学意义（P＜0.05）。N组肺动脉平滑肌层未见明显增厚，管壁均匀一致；H组肺动脉肌化明显，管腔明显狭窄，中膜平滑肌细胞明显增生，管壁明显增厚；HC组较H组肺动脉肌化减轻，管壁增厚好转，管腔狭窄不明显，见图1。

图1 3组大鼠肺血管HE染色图（×400）

2.4 3组PASMCs和肺匀浆NLRP3/Caspase-1/IL-1β轴相关蛋白表达量比较 与N组比，H组PASMCs的NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达明显升高，差异有统 计学意义（均P＜0.05）；与H组比，HC组PASMCs的 NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与N组比，HC组NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2 和图2。与N组比，H组大鼠肺匀浆的NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达明显升高，差异有统计学意义（均P＜0.05）；与H组比，HC组大鼠肺匀浆的NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3和图3。

表2 3组PASMCs NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表达量（每组6只，）

表2 3组PASMCs NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表达量（每组6只，）

与N组比：aP＜0.05；与H组比：bP＜0.05

组别 NLRP3 Caspase-1 IL-1β N组 0.191±0.037 0.184±0.070 0.030±0.011 H组 0.648±0.152a 0.629±0.076a 0.120±0.038a HC组 0.412±0.107ab 0.402±0.104ab 0.068±0.015ab

图2 3组PASMCs NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白Western blot图

3 讨论

PH是一类以肺血管重塑和肺血管阻力增加为特征的进展性疾病，病死率高，预后欠佳。PASMCs的异常增殖是肺血管重塑的重要因素[2，7]，肺动脉炎症反应在其中发挥重要作用[3]，目前临床上针对PH的治疗措施较为有限。抑制局部肺动脉炎症及PASMCs异常增殖可以缓解甚至逆转肺血管重塑和PH疾病进展，因此寻求该类的新型中药单体，并深入探究其作用机制和有效靶点十分重要。

表3 3组大鼠肺匀浆NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表达量（每组6只，）

表3 3组大鼠肺匀浆NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表达量（每组6只，）

与N组比：aP＜0.05；与H组比：bP＜0.05

组别 NLRP3 Caspase-1 IL-1β N组 0.143±0.049 0.239±0.057 0.022±0.006 H组 0.284±0.030a 0.875±0.125a 0.064±0.008a HC组 0.210±0.019ab 0.587±0.088ab 0.040±0.005ab

图3 3组大鼠肺匀浆NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白Western blot图

姜黄素是从姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种植物多酚，有研究报道其具有抗炎[4]、抗肿瘤[8]、抗氧化和心血管保护等作用。NLRP3复合体是一种大分子复合蛋白，由识别蛋白-NLRP3、衔接蛋白-凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated specklike protein containing CARD，ASC）和Caspase-1 组成[9]。Nod样受体（nod-like receptor，NLR）感知应激后聚集为NLRP3 寡聚体，通过ASC募集激活Caspase-1，将无活性的前体Caspase-1活化为剪切体Caspase-1（cleaved Caspase-1），cleaved Caspase-1可切割炎症因子IL-1β并使之成熟和释放，参与炎症反应[9-10]，在缺血再灌注、遗传性周期性发热综合征等疾病的发生发展中起到关键作用[11]。

至于PH相关研究领域，有报道称Caspase-1可调控炎症因子，参与PH的发生发展[12]；IL-1β可介导小鼠肺血管周围的巨噬细胞募集，促进PASMCs异常增殖，造成肺血管重塑，与PH的疾病进展密切相关[13]。YIN等[14]研究报道姜黄素可以通过抑制NLRP3炎性体，进而抑制IL-1β的分泌，起到抗炎的作用。由于炎症反应是低氧损伤的重要病理机制之一[15]，姜黄素可能通过抑制NLRP3炎性体，进而抑制Caspase-1的活化，从而减少IL-1β的成熟和释放，减轻炎症所致的PASMCs增殖，改善血管的重塑，最终降低HPH大鼠的肺动脉压力。

本研究发现姜黄素可以有效降低HPH大鼠的肺动脉压力，明显改善右心肥大及肺血管重塑，抑制低氧诱导的PASMCs异常增殖。进一步探究其作用机制和具体靶点，发现姜黄素可降低HPH大鼠肺匀浆以及低氧PASMCs中NLRP3、Caspase-1以及IL-1β的表达。姜黄素可能通过抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β轴减少低氧诱导的炎症反应，从而改善低氧PASMCs异常增殖和HPH大鼠肺血管重塑，从而降低肺动脉压力，对HPH有治疗作用。