miR-144对甲状腺乳头状癌细胞增殖及细胞周期的影响

余明军，赵娜，王海明

（杭州市第三人民医院 普外科，浙江 杭州 310009）

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，其中有约80%为甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[1]。近年来，甲状腺癌的发病率仍在迅速增长，PTC的增长速度尤为可观，占所有女性肿瘤榜首，而在男性肿瘤中居第2位[2]。大部分PTC在手术切除结合碘131及甲状腺素治疗后可达到临床治愈，但仍存在5%的5年复发率[3]。目前PTC的发病机制仍不明确，寻找治疗和诊断PTC的小分子标志物对于提高其诊断率和治疗效果都具有重要意义。

miRNA是一类长为21～25个核苷酸片段的小分子非编码RNA，在癌症的发生发展中扮演着重要角色。研究表明，miR-144在肺癌、鼻咽癌、肝癌、肾 癌、胰腺癌、结直肠癌和胃癌等癌症中发挥抑癌基因的作用[4-6]。JAHANBANI等[7]检测了113例甲状腺组织（其中包含81例PTC）中84种miRNA的表达情况，证实miR-144在PTC组织中低表达。另一项细胞水平的研究证实，miR-144可以通过抑制肿瘤细胞自噬，提高甲状腺未分化癌对铂类的化疗敏感性[4]。目前尚未见有研究涉及miR-144对PTC细胞增殖能力及细胞周期的影响。本研究检测了PTC细胞及正常甲状腺细胞中miR-144的表达水平，研究miR-144对PTC细胞增殖能力、单克隆形成能力及细胞周期的影响，可以为PTC早期诊断、预测复发以及找寻新的治疗靶点提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料 人PTC细胞K1、TPC-1 和人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1 均购自中国科学院上海细胞库。qPCR试剂盒购自上海欣百诺生物工程有限公司；RPMI1640 培养基和DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；miR-144 mimics、miR-144 inhibitor、NC mimics、NC inhibitor购自上海吉玛制药技术有限公司；脂质体LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；MTT溶液、DMSO溶液购自美国Sigma公司；流式周期检测试剂盒购自美国Sigma公司；兔抗人Anti-Cyclin D1购自美国Abcam公司，鼠抗人β-actin购自美国Epitomics公司；其他试剂均是国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：从液氮罐中取出人PTC细胞K1、TPC-1和人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1，放置于37 ℃水浴锅中，快速晃动至冻存液完全融化，加入预热的完全培养基（含青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL、 10% FBS的培养基，K1 细胞用DMEM培养，TPC-1和Nthy-ori 3-1细胞用RPMI1640培养），1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入完全培养基，置于培养箱（37 ℃，5% CO2，饱和湿度）中培养，次日更换培养液。定时观察细胞状态，当细胞融合至70%～90%时传代，加入胰蛋白酶（0.25%胰酶+0.02% EDTA）消化细胞2 min，小心吸去胰酶，加入新鲜完全培养基，用吸管吹打细胞成单细胞悬液，按1:3～1:2传代接种于培养瓶继续培养。

1.2.2 qPCR检测细胞中miR-144表达：取对数生长期的K1、TPC-1和Nthy-ori 3-1细胞，加入适量TRIozl细胞裂解液，反复抽吸吹打均匀，用无RNAase枪头将各孔液体分别转移到对应的1.5 mL无RNAase的EP 管中，静置5 min。加入100 μL氯仿，剧烈震荡15 s，室温静置5 min。4 ℃，12 000 r/min离心15 min。吸取水相层至新的EP管中，加入250 μL异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10 min。4 ℃，12 000 r/min 离心10 min沉淀RNA。弃上清液，加入500 μL预冷无水乙醇，震荡混匀。4 ℃，7 500 r/min离心 5 min，弃上清液。根据所用细胞数目，用30～50 μL DEPC水溶解沉淀。-80 ℃保存。用紫外分光光度计检测RNA的浓度及纯度，定量后用DEPC水将RNA稀释至500 ng/μL。按照反转录试剂盒说明书合成各组细胞miR-144的cDNA。按照RT-PCR试剂盒操作说明书扩增miR-144的cDNA。分析各组细胞中miR-144的表达水平。miR-144引物为：5’-CGGCGGTACAGTATAGA TGATG-3’；内参采用β-U6，引物为：正向：5’-CTCGC TTCGGCAGCACA-3’，反向：5’-AACGCTTCACGAATTTGCG T-3’。相对定量用2-△△CT法计算。

1.2.3 细胞转染：取对数生长期的K1细胞，消化收集细胞，接种于6孔细胞培养板中，调整初始细胞数为1.2×105，轻拍使细胞均匀分散，置于培养箱中培养。铺板24 h内，培养至细胞单层密度达到50%～60%时，按照LipofectamineTM2000脂质体转染试剂说明书提供的方法进行转染。实验分组为：阴性对照组（NC）、miR-144 mimics组和miR-144 inhibitor组。

1.2.4 MTT实验检测细胞增殖能力：转染NC、miR-144 mimics和miR-144 inhibitor 24 h后，收集各组细胞，接种于96 孔细胞培养板中，初始细胞数为1 500/孔，每组设置4 个复孔。设置24、48、72、96、120 h 5个时间点，分别进行检测。避光条件下，每孔加入MTT 溶液20 μL（5 mg/mL），孵育 4 h；终止培养，避光条件下，负压吸引器小心吸去上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，摇床上低速震荡10 min，使结晶充分溶解。使用多功能酶联免疫检测仪检测各孔在490 nm波长的吸光度（OD值），计算平均值，绘制细胞增殖曲线。

1.2.5 克隆形成实验检测细胞单克隆形成能力：各组转染24 h后收集细胞，各组细胞按500个/孔接种于6孔板中，每组设置3个复孔，轻轻晃动6孔板使细胞分散均匀。每孔补足完全培养基至1.5 mL，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养7～10 d，每2～3 d更换新鲜培养基。当6孔板中出现肉眼可见的细胞克隆时终止培养。弃去培养液，用PBS小心冲洗2次。用95%乙醇固定10 min，通风处风干。0.1%结晶紫溶液染色20 min，自来水小心冲洗。风干后拍照。

1.2.6 流式细胞术检测细胞周期：各组转染48 h后，用0.25%无EDTA的胰酶消化收集各组细胞，用PBS重悬细胞置于10 mL流式离心管中，室温2 000 r/min 离心5 min。弃去上清液，每管加2 mL PBS混匀，再次室温2 000 r/min离心5 min。弃去上清液，回流约50 μL残留PBS，轻弹离心管使细胞重悬，每管加入预冷的75%乙醇，轻弹混匀，4 ℃固定过夜。每管加入400 μL 0.05 g/L PI（碘化丙啶），室温避光孵育30 min，混匀，流式细胞仪上机检测。

1.2.7 Western blot检测细胞周期蛋白Cyclin D1的表达：各组转染48 h后倒掉培养基，各孔用1 mL预冷PBS冲洗3 次，PBS弃净后将培养板放在冰上。每孔加入80～100 μL裂解液，震荡混匀，冰上裂解30 min。用干净的刮棒将细胞刮下，将细胞碎片和裂解液移至1.5 mL EP管中，12 000 r/min，4 ℃，离心30 min，上清液转移至新的EP管中。经蛋白定量后，按体积加入一定量5×loading buffer， 100 ℃沸水水浴15 min使蛋白质变性，标记名称日期，-80 ℃保存。按照比例配制10%分离胶5%浓缩胶，各组蛋白上样，80 V电泳，待蛋白marker分开后调整为120 V，至溴酚蓝染料前沿到达凝胶末端，停止电泳。取出蛋白凝胶置于转膜液中平衡 15 min，200 mA转膜1 h。NC膜蛋白面向上放入5%脱脂牛奶封闭液中，室温于摇床低速摇动，封闭1 h。 封闭液稀释一抗：Cyclin D1：1/5 000，β-actin：1/1 000，一抗杂交，4 ℃摇床避光孵育过夜。PBST洗涤NC膜3次，每次10 min，加二抗室温避光孵育 2 h。PBST洗膜3次，NC膜蛋白面朝下上机扫描，应用Odyssey蛋白质分析成像系统显像，通过获取目的条带的灰度值作为表达强度。

1.3 统计学处理方法 应用SPSS22.0统计软件对数据进行分析，Graphpad Prism 6.0软件绘图。实验数据去除异常值，计量资料采用表示，所有试验均重复检测3次。多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞中miR-144的表达检测 人PTC细胞K1、TPC-1和人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1培养至对数生长期，经RNA提取，反转录合成cDNA后，qPCR检测细胞中miR-144的相对表达量。K1细胞中miR-144相对表达量为1.114±0.097，TPC-1细胞中miR-144相对表达量为1.555±0.110，甲状腺细胞Nthy-ori 3-1中miR-144的相对表达量为2.706±0.135。PTC细胞K1、TPC-1中的miR-144的相对表达量与甲状腺细胞相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。2种PTC细胞中K1细胞的miR-144表达量较TPC-1细胞低（P＜ 0.01）。

2.2 miR-144 对细胞增殖能力的影响 转染NC、miR-144 mimics和miR-144 inhibitor的K1细胞经MTT和DMSO处理，酶标仪检测转染后24、48、72、96、120 h的OD值。结果显示转染后24 h内，NC组、miR-144 mimics组和miR-144 inhibitor组的OD值差异无统计学意义（P＞0.05）。从转染后48 h 开始，3组细胞增殖能力开始出现差异，在转染后120 h差异显著：与NC组比，miR-144 mimics组细胞增殖明显受到抑制，而miR-144 inhibitor组细胞增殖活跃（P＜0.01），见图1。证明高表达miR-144可以明显抑制K1细胞的增殖能力，而低表达miR-144促进K1细胞增殖。

图1 MTT法检测miR-144对K1细胞增殖能力的影响

2.3 miR-144对细胞单克隆形成能力的影响 转染NC、miR-144 mimics和miR-144 inhibitor的K1细胞接种于6孔板，经过7～10 d培养，用0.1%结晶紫染色，拍照比较各组克隆形成情况。miR-144 mimics 组细胞克隆形成明显少于NC组，且其单个克隆大小也较NC组小；而miR-144 inhibitor组细胞克隆形成明显多于NC组，且其单个克隆大小也较NC组大。本研究结果证明过表达miR-144能够抑制K1细胞的单个细胞克隆形成能力，而抑制其表达则K1细胞的单个细胞克隆形成能力明显受促进。本研究结果进一步证实了高表达miR-144能抑制PTC细胞的增殖能力。见图2。

图2 miR-144对K1细胞单克隆形成能力的影响

2.4 miR-144对细胞周期的影响 PTC细胞株K1各组细胞转染后48 h，收集细胞进行流式细胞周期分析。如图3 所示，与NC组比，miR-144 mimics组G0/G1 期细胞占比明显增加，S、G2/M期细胞占比明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；与NC组比，miR-144 inhibitors组G0/G1期细胞占比明显减少，S、G2/M 期细胞占比明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）； 提示miR-144对K1细胞周期的影响主要表现在G0/G1 期阻滞。见表1。调控G1期-S期进程的细胞周期蛋白为Cyclin D1，为了进一步验证miR-144阻断K1细胞的G1期-S期进程，引起G0/G1期阻滞，本研究通过Western blot实验检测miR-144 mimics、miR-144 inhibitor及NC组转染K1细胞后Cyclin D1蛋白表达水平的变化情况。与NC组比，miR-144 mimics组Cyclin D1蛋白表达量明显下降，而miR-144 inhibitor组Cyclin D1蛋白表达量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图4。

图3 流式细胞技术检测miR-144对K1细胞周期的影响

表1 miR-144对K1细胞周期的影响（%）

3 讨论

甲状腺癌发病率占内分泌肿瘤的95%，在头颈部肿瘤中居首位。由于甲状腺癌早期临床症状不明显，使其早期诊断较为困难。恶性肿瘤细胞的迅速增殖、侵袭转移是癌症患者死亡的主要原因[8]。因此，研究其增殖、侵袭的分子机制至关重要。在PTC的发生发展中，miRNA起着极其重要的作用。一些研究已经证实PTC组织中存在很多miRNA的差异表达，并且发挥着促癌基因或抑癌基因的作用[4，7，9-10]。 目前甲状腺癌主要依靠临床症状、体征及多普勒彩色超声、头颈部CT、ECT等来进行诊断和鉴别诊 断[1]，甲状腺肿瘤miRNA表达谱的改变，可作为特殊的生物学标志用于早期诊断。修复或抑制miRNA在PTC细胞中的表达，有可能为开发抗肿瘤药物提供新思路。

图4 miR-144对K1细胞Cyclin D1蛋白表达的影响

有研究表明，miR-144 在包括甲状腺癌在内的多种癌症中表达下调[4-7]，在PTC细胞K1中下调miR-144可以增强癌细胞的侵袭能力，这一作用通过靶向ZEB1和ZEB2基因实现[10]。本研究通过实验证实miR-144在人PTC细胞表达显著降低，在生物学功能方面，miR-144通过抑制Cyclin D1的表达实现抑制细胞的有丝分裂，进而抑制细胞增殖，具体表现为miR-144高表达的细胞单克隆形成能力下降、细胞增殖率下降。由以上实验结果和文献资料我们推断，miR-144在甲状腺癌中发挥抑癌基因的作用，并且从细胞增殖、细胞周期及细胞侵袭等多方面阻断癌细胞的存活和扩散，但其能否作为新的治疗靶点投入到临床中还需要进一步深入研究。

综上所述，我们发现miR-144在PTC细胞中呈低表达，提高miR-144表达可以有效抑制PTC细胞的增殖能力，并且通过抑制Cyclin D1将细胞阻滞在G0/G1期。