脑缺血再灌注不同时间对大鼠海马神经元自噬及PI3K/mTOR通路的影响

邵锦根，杨江，陈浩浩，陶红苗，李旭升

（1.金华市人民医院 神经内科，浙江 金华 321000；2.金华职业技术学院 医学院，浙江 金华 321017）

缺血性脑卒中已成为严重危害我国居民生命健康的主要疾病之一[1]。研究发现，自噬是溶酶体介导的对体内受损细胞器及大分子物质进行降解的过程，自噬被过度激活后会导致细胞程序性死亡，与脑卒中的病理机制关系密切[2-3]。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路在自噬中发挥重要的调节作用[4]。海马是大脑中对缺血缺氧损伤极敏感的区域[5]。本研究用四血管阻断法建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型，探讨脑缺血再灌注不同时间对大鼠海马神经元自噬及PI3K/mTOR通路的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：健康雄性SD大鼠72只，体质量180～250 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：SCXK（沪）2013-0005，动物合格证号0267780。

1.1.2 实验试剂和仪器：栓线2634-A4型（北京沙东生物有限公司）；兔抗大鼠Beclin-1多克隆抗体（英国Abcam公司）；兔抗大鼠LC3 II多克隆抗体（英国Abcam公司）；p-PI3K、p-Akt及p-mTOR抗体（美国Santa Cruz公司）；FITC标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥科技有限公司）；BCA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；PVDF膜0.45 μm（美国Santa Cruz公司）；ECL化学发光试剂盒（美国Pierce Biotechnology公司）；Nikon摄影生物光学显微镜（日本Nikon公司）；Tecnai G2 Spirit Bio TWIN透射电镜（美国FEI公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和模型制备：参照文献[6]采用四血管阻断法建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型。大鼠适应性饲养7 d后，随机分为假手术组和缺血再灌注组。缺血再灌注组：夹闭双颈总动脉缺血 15 min[7]，分别恢复血流灌注0、6、12、24、36 h；假手术组：除不夹闭双侧颈总动脉外其他处理同缺血再灌注组。每组12只。缺血再灌注后从每组中随机选取5只对神经功能缺损进行评分，剩余大鼠立即断头取海马组织-80 ℃保存备用。

1.2.2 神经功能缺损评分：大鼠缺血再灌注不同时间后，从每组中随机选取5只，参考文献[8]对大鼠神经功能缺损进行评分。

1.2.3 缺血再灌注对大鼠脑梗死面积影响：参照文献[9]采用TTC染色法用于测量脑梗死面积。采用 ImageJ 1.45图像分析软件测量每张染色图片的梗死面积，梗死脑组织百分比=梗死区面积/（梗死面积+非梗死面积）×100%。

1.2.4 HE染色：取大鼠海马组织，4%甲醛溶液固 定，常规石蜡包埋，经二甲苯、乙醇、蒸馏水洗脱后，苏木精染色5 min，水洗后0.5%伊红液染色 3 min，蒸馏水冲洗、脱水、干燥后中性树胶封片，显微镜下观察海马组织切片。

1.2.5 透射电镜观察大鼠海马神经元自噬：参照文献[10]方法置于电镜下观察大鼠海马神经元自噬。

1.2.6 Western blot法检测海马组织自噬相关蛋白及PI3K/mTOR通路蛋白表达：取大鼠海马组织，剪碎，加入蛋白裂解液于冰上充分裂解30 min，4 ℃、 12 000 r/min离心10 min，上清液-80 ℃保存备用。BCA法测定蛋白浓度，取40 μg样品以10% SDS-PAGE电泳。电泳结束后半干法将分离的蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h。加入一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后加入HPR标记的二抗（稀释度1:5 000），37 ℃孵育2 h。TBST洗膜后加入ECL化学发光显色、曝光拍照。以β-actin为内参，BandScan软件分析蛋白条带灰度值。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计学分析。计量资料以表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑缺血再灌注不同时间大鼠神经功能缺损评分 与假手术组比，随着脑缺血再灌注时间的延长，0～24 h组大鼠神经功能缺损评分呈增加的趋势，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.2 脑缺血再灌注不同时间大鼠脑梗死面积 与假 手术组比，随着脑缺血再灌注时间的延长，0～24 h组大鼠脑梗死面积呈现增加的趋势，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

2.3 脑缺血再灌注不同时间海马组织HE染色形态 假手术组大鼠海马区神经细胞排列规整，结构完整，细胞核饱满。随着脑缺血再灌注时间的延长，大鼠海马区神经元数量逐渐减少，细胞核固缩、碎裂现象逐渐严重，见图3。

2.4 脑缺血再灌注不同时间海马神经元超微结构

假手术组大鼠海马神经元细胞核结构完整，染色质分布均匀，线粒体脊线清晰，自噬不明显。随着脑缺血再灌注时间的延长，海马神经元染色质固缩，线粒体出现损伤，有自噬泡出现，且脑缺血再灌注时间越长，自噬泡数量越多，见图4。

图1 脑缺血再灌注不同时间神经功能缺损评分（每组n=5）

图2 脑缺血再灌注不同时间大鼠脑梗死面积（每组n=5）

2.5 脑缺血再灌不同时间海马组织自噬相关蛋白表达 与假手术组比，随着脑缺血再灌注时间的延长，0～24 h组海马组织LC3 II蛋白表达呈增加趋势，p62 蛋白表达呈降低趋势，差异有统计学意义（均 P＜0.05）；与假手术组比，随着脑缺血再灌注时间的延长，0～36 h组海马组织Beclin-1蛋白表达呈增加趋势，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

2.6 脑缺血再灌不同时间海马组织PI3K/mTOR通路相关蛋白表达 与假手术组比，随着脑缺血再灌注时间延长，0～36 h组海马组织p-PI3K和p-Akt蛋白表达均呈下降趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）；与假手术组比，随着脑缺血再灌注时间延长，0～ 12 h组海马组织p-mTOR蛋白表达均呈下降趋势，差异有统计学意义（P＜0.05），见图6。

3 讨论

缺血性脑卒中是全球主要的致死及致残疾病之一，严重危害患者健康。脑缺血再灌注损伤在缺血性脑血管病病理生理过程中较为常见，其机制比较复杂，与多种病理环节相关，如自由基损伤、炎症介质释放、细胞凋亡和自噬等。

自噬是溶酶体介导的对体内受损细胞器及大分子物质进行降解的过程。正常生理状态下的自噬可维持机体内环境稳态，调控细胞损伤及防止细胞 老化[11]，但自噬被过度激活后，则会造成细胞程序性死亡，引起一系列疾病[12]。研究发现，脑缺血再灌注大鼠海马神经元变化与自噬密切相关。赵亚倩等[13]通过建立脑缺血再灌注大鼠模型发现脑缺血再灌注激活了大鼠海马神经细胞自噬，导致神经元细胞严重损伤，在神经细胞内观察到大量自噬小体。本研究结果显示，随着脑缺血再灌注时间延长，大鼠神经功能缺损评分增加，脑梗死面积增加，海马区神经出现核固缩和碎裂现象，肿胀明显，海马区自噬小体数量增加，这与赵亚倩等[13]报道的结果一致。

图3 脑缺血再灌注不同时间海马组织HE染色

图4 脑缺血再灌注不同时间海马组织透射电镜图

图5 脑缺血再灌不同时间海马组织Beclin-1、LC3 II和p62蛋白表达（每组n=7）

图6 脑缺血再灌注不同时间海马组织p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达（每组n=7）

自噬发生过程涉及多种蛋白的表达变化，Beclin-1是酵母ATG6的同系物，是一种参与自噬的特异性基因。研究发现，Beclin-1在脑缺血再灌注期间发挥至关重要的作用，Beclin-1表达上调可增强自噬，促进自噬体的形成和成熟[14]。LC3是目前公认的自噬体标记物，分为I型和II型，I型常规表达并游离存在于胞质中。自噬发生时，LC3 I磷脂化形成LC3-PE，即膜结合形式的LC3 II，LC3 II位于胞内自噬体的膜上，其含量高低可反映自噬小体数量[15]。 自噬发生时，p62与泛素化的蛋白质结合后再与自噬小体内膜上的LC3 II蛋白形成复合物，一同在自噬溶酶体内降解。当自噬活性减弱或自噬功能缺陷时，p62 蛋白在细胞质中不断累积，其含量高低可间接反映自噬小体清除水平[16]。SHU等[17]研究发现脑缺血再灌注大鼠Beclin-1和LC3 II蛋白表达显著升高，电针治疗可降低其蛋白表达，减轻自噬和细胞凋亡。WANG等[18]研究发现脑缺血/再灌注损伤后大鼠海马CA1区自噬体数量、Beclin-1蛋白表达及LC3 II/LC3 I比率均显著增加，p62蛋白表达显著降低。本研究结果显示，自噬相关蛋白beclin1、LC3 II表达均显著上调，且再灌注时间越长，蛋白表达越高，提示脑缺血再灌注可激活大鼠海马神经元自噬，再灌注时间越久，自噬越严重，与报道结果一致，说明脑缺血再灌注可激活大鼠海马过度自噬，损伤神经细胞。

PI3K/mTOR信号通路在自噬中起关键的调节作用。在生理条件下，酪氨酸激酶受体被活化后可激活PI3K，底物PIP2被活化的PI3K催化为PIP3，PIP3进而与磷酸肌醇依赖的激酶-1协同作用激活Akt，p-Akt将信号传递至mTOR，活化后的mTOR（p-mTOR）激活其下游的相关因子，进而促进细胞蛋白质合成、增殖和生长，加速细胞代谢，抑制其自噬[19]。研究发现，七氟醚预处理可激活PI3K/Akt信号通路，增强下游mTOR活性，进而降低缺血再灌注期间心肌细胞的自噬水平，发挥心肌保护作用[4]。王洁等[20]研究发现，丁苯酞可能通过P53/mTOR通路减少细胞自噬反应，保护脑缺血再灌注后损伤。本研究结果显示，缺血再灌注后，大鼠海马组织p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达均显著下降，且再灌注时间越长，蛋白表达越低，提示缺血再灌注抑制了大鼠海马区PI3K/mTOR信号通路。因此，通过药物作用激活PI3K/mTOR通路促进mTOR活性，可能降低缺血再灌注大鼠海马神经元自噬，起到脑保护的作用。

综上所述，脑缺血再灌注不同时间可增强大鼠海马神经元自噬，抑制PI3K/mTOR信号通路，但是具体作用机制还需要进行后续实验。