亚毒性浓度HNPG体外对X线照射人骨肉瘤Saos-2细胞 增殖抑制的增敏作用及机制

赵学正，高伟，唐保永，郑思化，李利军

（杭州市西溪医院 骨科，浙江 杭州 310023）

放疗是骨肉瘤综合治疗重要辅助治疗之一，术后和术前放疗的临床应用极大改善了骨肉瘤患者预后，然而目前使用的放疗增敏剂多是化疗药物，其发挥放疗的增敏作用的同时也表现出同化疗一样的不良反应，因此开发增敏作用强、不良反应小的新型放疗增敏剂便成为临床的研究热点之一[1]。 研究报道金雀异黄素（genstein，GEN）对放疗具有增敏效果，可显著提高放疗对肿瘤的治疗作用，而5-羟基-4’-硝基-7-丙酰氧基金雀异黄素（5-hydroxy-4’-nitro-7-propionyloxy-genistein，HNPG）是GEN的一种新型衍生物，在体外具有更强的抗肿瘤、抗氧化等作用[2-3]，然而其对放疗是否有增敏作用尚未见报道。本研究通过检测亚毒性浓度HNPG对亚毒性剂量的X线照射骨肉瘤Saos-2细胞的增敏作用，并进一步探究其可能的分子生物学机制，为HNPG对骨肉瘤的临床治疗提供实验依据和理论基础。

1 材料和方法

1.1 细胞培养和实验试剂 人骨肉瘤Saos-2细胞购自中国科学院上海生科馆细胞资源中心，用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃含5% CO2的饱和湿度的培养箱中进行培养。HNPG由第二军医大学生化实验室金永生教授合成赠送，分子式：C18H13O7N，相对分子质量：355，浅黄色粉末，纯度98%。所有照射均在室温下进行，采用医用直线加速器（Elekta Synergy，Elekta CompactTM，瑞典）照射，X线能量6 mV，剂量率6 Gy/min，源皮距SSD 100 cm，照射野10 cm×10 cm，于细胞上方加培养基至厚度为1.5 cm，使剂量建成在细胞层上，垂直照射。一抗bcl-2（A00040-1）、bax（A00183）、cyt-c（BA0774）、cleaved-caspase-3（BM3937）和GAPDH（A00227-1）购自美国BOSTER生物技术有限公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，A001-3）、过氧化氢酶（catalase，CAT，A007-1-1）、谷胱甘肽（glutathione，GSH，A006-1）、ROS（E004-1-1）和丙二醛（malondialdehyde，MDA，A003-4）测定试剂盒购自南京建成生物研究所。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（C0162）和线粒体膜电位检测试剂盒（C2006）购自上海碧云天生物公司。

1.2 MTT法检测亚毒性浓度HNPG对X线照射Saos-2细胞增殖抑制的增敏作用 取对数期生长的Saos-2细胞，以5 000/孔的密度种植在96孔培养板上，培养24 h待细胞完全贴壁后，每孔添加不同浓度的HNPG（0.5、1、2、4、8、16、32 μmol/L）作用骨肉瘤Saos-2细胞24 h，检测其对Saos-2细胞的增殖抑制作用，获取其亚毒性生物活性浓度并用于后续实 验。同样取另一组Saos-2细胞，每孔添加不同强度的X线（0.5、1、2、4、8、16、32 Gy）照射骨肉瘤Saos-2细胞24 h，检测其对Saos-2细胞的增殖抑制作用，获取其24 h亚毒性抑制强度并用于后续实验。取亚毒性浓度2 μmol/L HNPG、亚毒性放射剂量1 Gy X线、2 μmol/L HNPG+1 Gy X线分别作用Saos-2细胞24 h，然后移除培养液，添加5 mg/L MTT继续培养 4 h，移除MTT混悬液，添加100 μL DMSO，570 nm检测光密度（型号：ELX-800 type）。细胞增殖抑制率（IR）=（1-实验组A均值/空白对照组A均值）×100%。以上实验重复3次。分别记为HNPG组，X线组，HNPG+ X线组。以0.9%氯化钠溶液作用为对照（NS组）。

1.3 AV/PI染色流式细胞术（flow cytometry，FCM） 检测亚毒性浓度HNPG对X线照射Saos-2细胞凋亡的增敏作用 取对数期生长的Saos-2细胞，培养24 h后完全贴壁后，更换培养基，用2 μmol/L HNPG、 1 Gy X线、2 μmol/L HNPG+1 Gy X线分别作用Saos-2细胞24 h，弃去培养基，用PBS清洗2遍，用0.25%的胰酶消化细胞并吹打成单个细胞悬液，以2 000 r/min离心5 min，弃上清液保留细胞沉淀，分别使用1 mL的50 mmol AV和PI溶液混悬细胞，于37 ℃避光孵育30 min，再用无血清的DMEM溶液洗涤细胞3次，用流式细胞仪进行检测AV-PI荧光强度，激发波488 nm和发射波530 nm。实验重复3次，取平均值进行统计分析。

1.4 Rh123染色FCM法检测亚毒性浓度HNPG对X线照射Saos-2细胞线粒体膜电位调控的增敏作用 取对数期生长的Saos-2 细胞，培养24 h后完全贴壁后，更换培养基，用2 μmol/L HNPG、1 Gy X线、 2 μmol/L HNPG+1 Gy X线分别作用Saos-2细胞24 h， 弃去培养基，用PBS清洗2遍，用0.25%的胰酶消化细胞并吹打成单个细胞悬液，以2 000 r/min离心5 min，弃上清液保留细胞沉淀，用500 μL Rh123溶液（终浓度为5 μg/mL）混悬细胞，于37 ℃避光孵育30 min，再用无血清的DMEM溶液洗涤细胞3次，再用PBS洗涤细胞2次，用40 μm的滤网过滤细胞。用流式细胞仪进行检测Rh123 荧光强度，激发波 475 nm和发射波525 nm。实验重复3次，取平均值进行统计分析。

1.5 DCFH-DA染色FCM法检测亚毒性浓度HNPG对X线照射Saos-2细胞活性氧调节的增敏作用 取对数期生长的Saos-2细胞，培养24 h后完全贴壁后，更换培养基，用2 μmol/L HNPG、1 Gy X线、2 μmol/L HNPG+1 Gy X线分别作用Saos-2细胞24 h，弃去培养基，用PBS清洗2遍，用0.25%的胰酶消化细胞并吹打成单个细胞悬液，以2 000 r/min离心5 min，弃上清液保留细胞沉淀，用1 mL的50 mmol DCFHDA溶液混悬细胞，于37 ℃避光孵育30 min，再用无血清的DMEM溶液洗涤细胞3次，除去未进入细胞内的DCFH-DA，用40 μm的滤网过滤细胞。用流式细胞仪进行检测DCFH-DA荧光强度，激发波488 nm和发射波530 nm。实验重复3次，取平均值进行统计分析。

1.6 ELISA法检测亚毒性浓度HNPG对X线照射Saos-2 细胞SOD、CAT、GSH和MDA调节的增敏作用

取对数期生长的Saos-2细胞，培养24 h后完全贴壁后，更换培养基，用2 μmol/L HNPG、1 Gy X线、2 μmol/L HNPG+1 Gy X线分别作用Saos-2细胞24 h， 用0.25%的胰酶消化细胞并吹打成单个细胞悬液，以800 r/min离心5 min，弃上清液保留细胞沉淀，用冰PBS混悬细胞，再以800 r/min离心5 min，弃上清液保留细胞沉淀，加入细胞裂解液，冰上裂解 30 min，12 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白密度测定。按照SOD、CAT、GSH和MDA试剂盒说明书分别在550 nm、405 nm、420 nm和532 nm处对SOD和CAT活力进行测试，对GSH和MDA含量进行测试。实验重复3次，取平均值进行统计分析。

1.7 Western blot法检测亚毒性浓度HNPG对X线照射Saos-2细胞凋亡相关蛋白调节的增敏作用 取对数期生长的Saos-2细胞，培养24 h后完全贴壁后，更换培养基，用HNPG 2 μmol/L、X线1 Gy、HNPG 2 μmol/L+X线1 Gy分别作用Saos-2细胞24 h，用冰PBS洗3次，加入细胞裂解液提取蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，取30 μg样品用SDSPAGE电泳分离，然后将蛋白转移至PVDF膜上，再用5%脱脂牛奶-TBST室温摇床封闭2 h，一抗于37 ℃温育3 h，二抗于37 ℃温育1 h，ECL发光剂激发荧光，压片显影定影。结果用灰度扫描仪处理分析。

1.8 统计学处理方法 采用SPSS18.0软件对实验数据分析。正态分布的计量资料以表示，2组比较采用t检验，多组比较用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 亚毒性浓度HNPG对X线照射Saos-2细胞增殖抑制的增敏作用 取不同浓度的HNPG（0.5、1、2、4、 8、16、32 μmol/L）作用骨肉瘤Saos-2细胞24 h，发现HNPG对细胞的增殖抑制呈浓度依赖性，其中在2 μmol/L浓度以下，HNPG对细胞的作用处于亚毒性范围之内，抑制率均小于15%，见图1A。取不同照射强度X线（0.5、1、2、4、8、16、32 Gy）的X线，发现X线对细胞的毒性呈强度依赖性，其中在1 Gy强度下，细胞呈亚毒性，细胞的抑制率均小于15%，见图1B。取2 μmol/L HNPG联合1 Gy X线，发现细胞的增殖抑制率显著提高，分别与HNPG组或X线组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），而HNPG组和X线组比较，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1C。

2.2 亚毒性浓度HNPG对X线照射Saos-2细胞凋亡的增敏作用 取对数期生长的Saos-2 细胞，分别予以2 μmol/L HNPG、1 Gy X线和2 μmol/L HNPG+ 1 Gy X线持续培养24 h后，用FCM检测发现Saos-2细胞出现不同程度的凋亡，凋亡率分别为10.60%± 0.87%、9.49%±0.69%、50.37%±4.13%，较NS组（0.1%±0.01%）显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。HNPG+X线组与HNPG组和X线组比，凋亡率显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。HNPG组和X线组凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。提示HNPG对X线照射Saos-2细胞有显著的增敏作用，见图2。

2.3 亚毒性浓度HNPG对X线照射Saos-2细胞活性氧调控的增敏作用 取对数期生长的Saos-2细胞，分别予以2 μmol/L HNPG、1 Gy X线和2 μmol/L HNPG+1 Gy X线持续培养24 h后，用FCM检测发现Saos-2细胞DCFH-DA荧光强度出现不同程度的增强，荧光强度分别为1.51±0.11、1.28±0.10、8.12± 0.64，较NS组（0.78±0.06）显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。HNPG+X线组荧光强度与HNPG组和X线组比显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；HNPG组与X线组细胞荧光强度相当，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图1 亚毒性浓度HNPG对X线照射骨肉瘤Saos-2细胞增殖抑制的增敏作用

图2 亚毒性浓度HNPG对X线照射骨肉瘤Saos-2细胞诱导凋亡的增敏作用

2.4 亚毒性HNPG对X线照射Saos-2细胞线粒体膜电位调控的增敏作用 取对数期生长的Saos-2细胞，分别予以2 μmol/L HNPG、1 Gy X线和2 μmol/L HNPG+1 Gy X线持续培养24 h后，用FCM检测发现Saos-2细胞平均Rh123荧光强度分别为6.16±0.42、6.67±0.48、1.18±0.08，与NS组（7.25±0.56）比显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。HNPG+X线组荧光强度与HNPG组和X线组比显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。HNPG组和X线组平均Rh123荧光强度比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

2.5 亚毒性HNPG对X线照射Saos-2细胞调节SOD、CAT、GSH和MDA表达的增敏作用 取对数期生长的Saos-2细胞，分别予以2 μmol/L HNPG、1 Gy X线和2 μmol/L HNPG+1 Gy X线持续培养24 h后，分别用SOD、CAT、GSH和MDA试剂盒检测发现Saos-2细胞SOD和CAT活力出现不同程度的下降，GSH含量出现不同程度的降低，而MDA含量却出现不同程度的升高，与NS组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。HNPG+X线组与HNPG组和X线组比差异有统计学意义（P＜0.05）。HNPG组和X线组SOD和CAT活力、GSH和MDA含量相当，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.6 亚毒性浓度HNPG对X线照射Saos-2细胞调节线粒体凋亡途径相关蛋白的增敏作用 取对数期生长的Saos-2细胞，分别予以2 μmol/L HNPG、1 Gy X线和2 μmol/L HNPG+1 Gy X线持续培养24 h后，提取细胞蛋白并检测蛋白印迹平均相对灰度值，发现Saos-2细胞bcl-2蛋白表达呈浓度依赖性下调，与NS组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）；而bax、cyt-c和cleaved-caspase-3蛋白表达却呈浓度依赖性上调，与NS组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；HNPG+X线组与HNPG组和X线组比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

图3 亚毒性浓度HNPG对X线照射骨肉瘤Saos-2细胞活性氧调节的增敏作用

3 讨论

目前针对骨肉瘤的治疗模式是以手术为主，化疗和放疗为辅，然而随着放疗技术的不断发展，尤其是新型放疗模式的变革，放疗效果显著提高，在很大程度上改善患者的生存质量和预后，这使放疗成为骨肉瘤最为重要的治疗方式之一[4]。临床上为了使放疗达到最佳的治疗效果，通常在放疗的基础上采用放疗增敏剂；增敏剂的应用，提高了放疗的治疗效果，减少了放疗剂量，减少了放疗的不良反应。但是，目前放疗增敏剂多系化疗药物，其依旧存在化疗的不良反应，并产生耐药性，严重限制了它们的临床应用，为此开发不良反应小，增敏效果强的新型放疗增敏剂，便成了临床研究的工作热点之一[5]。本研究检测亚毒性浓度HNPG对X线照射骨肉瘤Saos-2细胞增殖抑制的增敏作用，并进一步探讨其可能的分子生物学机制。

细胞内抗氧化酶系统包括SOD、CAT、GSH等，抗氧化酶系的存在对维持细胞内环境稳态起着至关重要的作用[6]。SOD在细胞内以超氧负离子自由基为底物，催化其发生歧化反应并生成无毒的氧或过氧化氢，直接对抗氧自由基和活性氧的抗氧化酶[7]； 而CAT能有效催化过氧化氢为无毒物质氧[8]；GSH可以有效催化过氧化氢为无毒物质氧和水[9]；SOD、CAT、GSH等共同构成了细胞内抗氧化的酶系统，因此测定SOD、CAT、GSH含量，可以间接体现机体对氧自由基和活性氧的清除能力[10]。细胞内的氧自由基或活性氧，可以攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并形成MDA等脂质过氧化物，因而测试MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度[11]。本研究发现，亚毒性浓度的HNPG和亚毒性剂量的X线联合处理Saos-2细胞后，细胞增殖抑制显著加强，凋亡现象明显增加，细胞内ROS累积增多，伴随着SOD和CAT生物活性降低，GSH含量降低，而MDA含量增高，提示亚毒性浓度的HNPG可以增敏X线对Saos-2细胞的放疗效果，其机制可能与其下调SOD、CAT、GSH表达，导致细胞内ROS不能被清除，进而引起线粒体磷脂膜受损密切相关。这与ARAVINDAN等[12]研究GEN增强放疗抑制乳腺癌细胞的效果和机制相似，提示GEN和它的新型衍生物HNPG均可增强肿瘤细胞放疗效果。

在线粒体的双层磷脂酶上有bcl-2和bax蛋白，它们共同构成的线粒体器膜转化孔，调节并保持线粒体内外电解质的平衡，并维持着线粒体膜内外存在一定的膜电压[13-14]；一旦线粒体细胞器膜受损，引起bcl-2和bax蛋白表达失调，就会导致线粒体膜内外电解质调节障碍，引起线粒体膜电位下降，同时线粒体内物质外泄，而这些线粒体内的物质，诸如cyt-c等，一旦进入细胞质中，就会激活细胞质中半胱氨酸蛋白酶家族（caspase家族），最终激活凋亡效应蛋白cleaved-caspase-3产生并诱导细胞凋 亡[15-16]。本研究发现亚毒性浓度的HNPG和亚毒性剂量的X线联合处理Saos-2细胞后，细胞增殖抑制显著，凋亡现象明显，线粒体膜电位MMP降低，伴随着bcl-2 表达降低，而bax、cyt-c和cleaved- caspase-3蛋白表达增加，提示亚毒性浓度的HNPG在体外可增敏X线对Saos-2细胞增殖抑制作用，其机制可能与其诱发细胞内线粒体凋亡途径相关。这与SAHIN等[17]研究GEN增强放射治疗前列腺癌细胞的效果和机制相似，提示GEN和它的新型衍生物HNPG在体外均可增强肿瘤细胞放疗效果。

图4 亚毒性浓度HNPG对X线照射骨肉瘤Saos-2细胞线粒体膜电位调节的增敏作用

表1 亚毒性浓度HNPG对X线照射Saos-2细胞调节SOD、CAT、GSH和MDA表达的增敏作用（每组n=3，

表1 亚毒性浓度HNPG对X线照射Saos-2细胞调节SOD、CAT、GSH和MDA表达的增敏作用（每组n=3，

与NS组比：aP＜0.05；与HNPG组比：bP＜0.05；与X线组比：cP＜0.05

组别 SOD（U/mg prot） CAT（U/mg prot） GSH（mg/g prot） MDA（nmol/mg prot）NS组 40.18±3.02 8.89±0.52 10.27±0.84 4.48±0.37 HNPG组 35.46±2.83a 6.52±0.47a 9.08±0.87a 5.54±0.39a X线组 33.98±3.01a 6.08±0.39a 9.15±0.81a 5.76±0.47a HNPG+X线组 15.72±1.03abc 4.38±0.37abc 4.26±0.33abc 10.73±0.86abc

图5 亚毒性浓度HNPG对X线照射骨肉瘤Saos-2细胞调节凋亡相关蛋白表达的增敏作用

综上所述，亚毒性浓度的HNPG和亚毒性X线放射治疗剂量联合使用在体外对骨肉瘤Saos-2细胞展示的显著的细胞毒性，抑制细胞增殖和诱导其凋亡的作用显著提升，其分子生物学机制可能是与亚毒性浓度的HNPG促进X线下调细胞内SOD、CAT、GSH抗氧化的酶表达，降低其在肿瘤细胞内清除ROS的活性，导致细胞内ROS累积，进而损伤肿瘤细胞线粒体磷脂膜，降低细胞膜电位，引起线粒体功能紊乱，使cyt-c等诱发细胞凋亡的酶进入细胞质内，激活caspase酶链式反应，引起细胞凋亡所致。