4株绿僵菌的鉴定及对松褐天牛成虫致病效果比较*

张亚波 张 威 张守科 彭 瀚 孟 珂 舒金平 王浩杰

(1. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 富阳 311400； 2. 河南科技学院 新乡 453003)

松褐天牛(Monochamusalternatus)属鞘翅目(Coleoptera)天牛科(Cerambycidae)墨天牛属(Monochamus)，是马尾松(Pinusmassoniana)、湿地松(P.elliottii)等松属植物主要的蛀干害虫，其成虫也是松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)的主要传播媒介，在松材线虫病的发生和扩散过程中发挥着关键作用(Stampsetal.， 2001； 展茂魁等， 2014)。

防治松褐天牛、切断松材线虫的侵染循环是松材线虫病综合治理的关键。松褐天牛幼虫钻蛀为害，隐蔽性较强，幼虫期防控难度较大，防治幼虫不仅耗费较高的成本，而且防控效率较低(史先慧等， 2017)。松褐天牛成虫羽化后会钻出树干自由活动，进行补充营养和交尾产卵，同时传播松材线虫，成虫期防控可以降低松褐天牛数量、减少松材线虫对松树的感染(赵锦年等，1989； 林长春等， 2002)。

绿僵菌(Metarhiziumspp.)和白僵菌(Beauveriaspp.)是应用最为广泛的2类昆虫病原真菌，在农、林以及卫生害虫的防治中越来越受到人们的重视(Donaldetal.， 2004； 张亚波等， 2014)。关于白僵菌防治松褐天牛方面已取得较多进展(张立钦等， 2000； Shimazu， 2004； 刘洪剑， 2007)，释放的生防菌株能够定殖于生态系统中，且有取代土著菌株优势地位的趋向(赵学球等， 2007)。但利用绿僵菌防治松褐天牛的研究报道相对较少，何学友等(2007； 2008)分离筛选到了感染松褐天牛的9个金龟子绿僵菌菌株，潘永胜等(2010)筛选到了3个绿僵菌菌株。绿僵菌与白僵菌相比，绿僵菌具有较强的耐高温和耐旱特性(江英成， 2000； 宋漳等， 2003)。所以，挖掘对松褐天牛高毒力的绿僵菌菌株具有重要的应用前景。

由于不同学者所采用的菌株标本并非同一模式，绿僵菌有关属种的形态描述存在不一致的情况，致使在绿僵菌分类地位的研究中出现了许多争议(Rezendeetal., 2015)。单纯依靠形态特征来对绿僵菌属种进行分类，很难将绿僵菌相近的种区分开来，利用分子生物学的研究技术有助于解决绿僵菌属近缘种的分类难题。延伸因子EF-1α是真菌普遍存在和参与蛋白质翻译的蛋白，由于EF-1α编码基因序列在种内具有较高的保守性，而在不同种间具有规律性的进化差异，因此，EF-1α基因序列被广泛地应用于真菌近缘种的鉴定以及真菌遗传多样性分析(Bischoffetal., 2009； Kepleretal., 2014； 郭庆港等， 2018)。本文选用几株产孢好的绿僵菌菌株对松褐天牛成虫进行生物测定，同时进行形态学和EF-1α编码基因序列分析，重新明确4株绿僵菌的分类地位，旨在筛选出对松褐天牛成虫具有高毒力的菌株，同时探讨了施菌方式对致病性的影响，为生物防治松褐天牛奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试虫来源及饲养

松褐天牛成虫为马尾松虫害木置于室外不锈钢纱网的养虫笼饲养羽化所得，虫害木主要来自浙江省杭州市富阳区。供试松褐天牛成虫为3～5日龄、个体大小基本一致，并按日龄大小平均分配到各处理中。试虫用新鲜的1年生马尾松嫩枝在开有通气孔的透明塑料杯 (上口12 cm、下口8 cm、高15 cm) 中单头饲养，每天换1次嫩枝。

1.2 供试菌株

1)绿僵菌WP08菌株，由中国林业科学研究院亚热带林业研究所森林健康与保护研究室分离，提交中国科学院微生物菌种保藏中心(CGMCC No.4226)专利保存，该菌株分离自筛胸梳爪叩甲(Melanotuscribricollis)幼虫僵虫体上。

2)绿僵菌LV2菌株，由海南热带植物研究所提供，该菌株分离自椰心叶甲(Brontispalongissima)僵虫体上。

3)绿僵菌WTKH菌株，由河北农业大学提供，分离寄主不详。

4)绿僵菌qc1401菌株，该菌株由作者分离自蛴螬(Popilliasp.)幼虫僵虫体上，保存在中国林业科学研究院亚热带林业研究所森林健康与保护研究室内。

1.3 培养基和试剂

培养基为PPDA(去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g、蛋白胨10 g、水1 000 mL)。Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司； PCR引物合成及序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。

1.4 绿僵菌形态特征观察

在无菌条件下，挑取少量分生孢子粉，加10 mL的0.05%Tween 80溶液配制成孢子悬浮液，振荡混匀后用血球计数板测定悬浮液中分生孢子浓度，并适当调整使之达到1.0×108个·mL-1。各取2 μL孢子悬浮液分别点接于PPDA培养基平板上，置于25 ℃恒温培养14天(QHX-300BS-III，上海新苗医疗器械制造有限公司)，观察记录菌落特征，在显微镜(蔡司生物显微镜Primo Star)下观察菌丝和孢子形态，测量100个分生孢子大小。

1.5 分子生物学鉴定

1.5.1 EF1α-5’序列的PCR扩增及测序 将供试菌株接种PPDA平板，25 ℃下培养14天，刮取孢子，液氮研磨后，利用CTAB法提取总DNA。以之为模板，采用引物EF1T(5′-ATGGGTAAGGARGAC AAGAC-3′)与EF2T(5′-GGAAGTACCAGTGATC ATGTT-3′)进行PCR扩增(Rehner and Buckley， 2005)。PCR反应体系： 共25.0 μL，其中DNA模板1.0 μL(<1 μg)、EF1T(10 pmol·μL-1)0.3 μL、EF1T(10 pmol·μL-1)0.3 μL、10×Buffer缓冲液(无Mg2+)2.5 μL、Mg2+(25 mmol·L-1)1.5 μL、dNTP(2.5 mmol·L-1)1.5 μL、Taq聚合酶(2.5 U·μL-1)0.15 μL、ddH2O 17.75 μL。PCR扩增条件为： 94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s、54 ℃ 40 s、72 ℃ 0 s、30个循环，72 ℃10 min。PCR产物用1.0%的琼脂糖电泳检测。由上海生工生物工程技术有限公司测序。

1.5.2 序列分析 将获得的EF-1α基因5’序列提交GenBank数据库，同时在GenBank数据库中进行Blast分析，找出与之有最大相似性的几个序列，并下载其他几种绿僵菌的相关序列。将下载的序列分别和本研究中的4条序列利用MEGA 6.0中ClustalW进行序列比对，采用Neighbor-joining(NJ)构建系统发育树，其中选用的模型是Maximum Composite，运用Bootstrap检验重复，抽样1 000次，其余参数为默认选项。

1.6 4株绿僵菌对天牛的毒力测定

1.6.1 孢子悬浮液配制 将供试绿僵菌置于PPDA培养基上培养14天，将真菌的分生孢子粉刮到一个干净无菌的盛有10 mL 0.05% Tween 80的三角瓶中，充分振荡，然后加入无菌水，用血球计数板法计算孢子溶液浓度。供试孢子的萌发率均在97%以上。

1.6.2 无纺布菌条制作 液体母种参考徐金柱等(2006)方法制作。培养基制作方法参照徐金柱等(2007)，黄豆粉40 g·L-1、白砂糖20 g·L-1、蛋白胨6 g·L-1，接种量为种子∶辅料=1∶2，25 ℃下，RH 95%培养至产孢。无纺布孢子含量为3.5×108个·cm-2。

1.6.3 试验条件 试验均在室内自然变温24～33 ℃，相对湿度40%～60%条件下测定绿僵菌对松褐天牛成虫的致病力。试虫死后保湿培养，观察菌丝生长及产孢情况。

1.6.4 致病力测定 1)浸枝法： 取健康新鲜的马尾松1年生嫩枝，洗净晾干后，分别将供试菌株以0.05%的Tween 80灭菌水配制成浓度为1.0×108个·mL-1的分生孢子悬浮液，并逐级稀释使浓度为1.0×106、1.0×107、1.0×108·个·mL-1，将马尾松嫩枝(直径0.8 cm、长12 cm)分别在孢子悬液中浸30 s，晾干嫩枝，将其放入消毒的干净塑料杯中，松褐天牛成虫接至塑料杯中饲养； 同时放置棉球保持湿度。以喷0.05%的Tween 80灭菌水的马尾松嫩枝饲养为对照，每处理试虫10头，重复3次，处理后每天观察1次，记录死亡虫数，直至处理后第40天。

2)浸虫法： 分别将供试4个绿僵菌菌株以0.05%的Tween 80灭菌水配制成浓度为1.0×108孢子·mL-1的分生孢子悬浮液，采用浸渍法接种(潘永胜等， 2010)，将试虫在孢子悬浮液中浸1 s进行接种，以0.05%的Tween 80灭菌水为对照，每个处理设3个重复，重复10头试虫。处理后的试虫放入装有新鲜马尾松嫩枝的塑料瓶中饲养，同时放置棉球保持湿度，每天记录死亡虫数，连续观察40天。

3)无纺布法： 为了检测孢子的飘移是否会增加天牛成虫的感染机会，在室内进行观察试验。以100 cm×100 cm×100 cm尺寸制作养虫笼，用不锈钢纱网包裹。笼内放置新鲜马尾松嫩枝饲养天牛； 无纺布菌条固定于笼外30 cm，高50 cm处，使用风扇送风将孢子吹入笼内。处理3个重复，以无菌布条为对照，每天记录死亡虫数，连续测定观察40天。

1.7 数据分析

根据各处理下供试昆虫的死虫数，按下式计算累计死亡率和校正死亡率：

死亡率(%)=死亡虫数/供试总虫数×100,

校正死亡率(%)=(处理组死亡率-对照组死亡率)/(100-对照组死亡率)×100。

数据统计采用Spss 17.0中ProBit进行回归分析，并计算半数死亡时间LT50。

2 结果与分析

2.1 4株绿僵菌的形态特征

4个供试菌株在PPDA培养基上菌落特征不同，分生孢子形态及大小差异较大。菌株WP08和WTKH菌落初期边缘白色，菌丝浓密，中央产生暗绿色、厚而密的分生孢子层，后期2个菌株分生孢子层颜色不同。WP08后期分生孢子层颜色呈橄榄色，WTKH分生孢子层颜色呈灰褐色； 菌株qc1401和LV2菌落气生菌丝较多，qc1401菌株培养至后期分生孢子层颜色变淡呈灰橄榄色，LV2分生孢子层颜色呈黑褐色。4个绿僵菌的分生孢子在形态上存在一定的差异。WP08、WTKH和LV2菌株的孢子呈长椭圆形，但WP08和WTKH菌株的孢子个体较小[(4.9～7.2) μm×(1.4～2.8) μm]，LV2菌株的孢子相对较大[(5.0～8.1) μm×(2.5～3) μm]，qc1401菌株孢子两端钝圆，大小为(7.0～9.0) μm×(2.0～3.0) μm(图1)。

图1 不同绿僵菌菌株的菌落特征和分生孢子形态Fig.1 Colony morphology and Conidiospora feature of four Metarhizium spp. isolates

2.2 4株绿僵菌EF1α基因序列分析

对4个菌株的EF1α基因5’序列进行扩增，将所得序列输入到GenBank数据库中进行Blast分析，在构建的系统树中，外群球孢白僵菌独立于系统树的基部，与各绿僵菌菌株的遗传距离很远。供试的绿僵菌菌株聚类为4个主要组群，即平沙绿僵菌(M.pingshaense)、罗伯茨绿僵菌(M.robertsii)、金龟子绿僵菌(M.anisopliae)和瘿绵蚜绿僵菌(M.pemphigi)。供试菌株WTKH和WP08划分在平沙绿僵菌组群中，结合形态学特征将WTKH和WP08鉴定为平沙绿僵菌； LV2划分在金龟子绿僵菌组群中，结合形态学特征将其鉴定为金龟子绿僵菌； 菌株qc1401划分在瘿绵蚜绿僵菌组群中，根据Kepler等(2014)提出的黄绿绿僵菌的分类系统，将其鉴定为瘿绵蚜绿僵菌Metarhiziumpemphigi(Driver & R.J. Milner) Kepler。

2.3 松褐天牛绿僵菌侵染特征

松褐天牛成虫被绿僵菌感染后，最初表现为活动迟缓，食量减少，而后停止活动，虫体僵化。保湿培养后从成虫触角节间膜上或从成虫头部、胸部、腹部及足部的节间长出白色菌丝体，最后白色菌丝上出现绿色孢子堆(图3)。

2.4 不同绿僵菌菌株对松褐天牛的致死率

采用浸虫法测定4个绿僵菌菌株对松褐天牛的毒力。供试的4个绿僵菌菌株对松褐天牛表现出不同程度的致病效果，其中校正死亡率较高的是平沙绿僵菌WP08菌株和金龟子绿僵菌LV2菌株，40天的试验期内死亡率达到100%； 黄绿绿僵菌qc1401死亡率为91.9%，平沙绿僵菌WTKH菌株的校正死亡率为87.9%； 对照组死亡率为16.67%(表1)。

图2 基于EF-1α基因5’序列构建的绿僵菌菌株系统进化树Fig.2 Evolution tree of the different Metarhizium strains based on the 5’ end of EF-1α sequences

图3 松褐天牛被绿僵菌侵染死亡特征Fig.3 Death symptom of M. alternatus infected by Metarhizium spp.

2.5 绿僵菌对松褐天牛的致死速度

4株绿僵菌采用浸虫法接种松褐天牛，试验结果表明4株绿僵菌对试虫的致死速度不同，供试绿僵菌中WP08菌株开始致死时间较早，致死速度较快(图4)，LT50为5.52天； 其次为LV2菌株的致死速度也较快，LT50为10.38天，qc1401菌株的致死时间和致死速度相对较慢，半数死亡时间较长，WTKH菌株的致死时间和致死速度介于LV2和qc1401之间(表1)。

表1 不同绿僵菌菌株对松褐天牛的毒力测定Tab. 1 Toxicity test of different Metarhizium isolates to M. alternatus

图4 不同绿僵菌对松褐天牛的毒力测定Fig.4 Pathogenic effect of different Metarhizium isolates to M. alternatus

2.6 WP08菌株不同孢子浓度致病力分析

以平沙绿僵菌WP08菌株为供试菌株，采用浸枝法接种松褐天牛成虫，从表2可以看出，孢子浓度越高则半数死亡时间越短。当孢子浓度为1.0×108个mL-1时，半数死亡时间LT50为11.38天。随着孢子浓度的降低，半数死亡时间也随之延长，当孢子浓度为1.0×106个mL-1时，LT50为24.22天(表2)。从图5中可以看出，较高孢子浓度可以更早地导致试虫死亡。在孢子浓度的试验中，从试虫开始死亡直至试验截止，各个浓度总会有一段试虫集中死亡的时间，而后死亡速率减慢。部分试虫集中死亡后，个别试虫到试验后期才死亡，累积死亡率曲线呈现对数型。

2.7 接种方式对松褐天牛的致病效果

以平沙绿僵菌WP08为供试菌株，采用浸枝法、浸虫法和无纺布法均可致试虫死亡。施菌40天内供试松褐天牛死亡率均为100%，浸虫法的LT50为5.52天； 浸枝法LT50为11.38天； 无纺布法LT50为17.21天。对照组死亡率为16.67%； 浸虫法致死速率均高于浸枝法和无纺布法(表3)。

图5 不同孢子浓度下绿僵菌对松褐天牛的致病效果Fig.5 Pathogenic effect to M. alternatus in different spore concentrations

表3 绿僵菌不同接种方法对松褐天牛的致病效果Tab.3 Pathogenic effect to M. alternatus in different inoculation method

3 讨论

关于绿僵菌的分类一直是众多学者的研究热点。Tulloch(1976)根据形态特征将绿僵菌划分为金龟子绿僵菌、黄绿绿僵菌(M.flavoviride)和白色绿僵菌(M.album)3个种。但是，由于绿僵菌属内形态差异微小，而菌落特征受培养条件的影响，分生孢子大小和形态存在一定变化范围，单纯依靠形态特征来对绿僵菌属种进行分类具有较大局限性(王峰等， 2017)，利用分子生物学的研究技术有利于解决绿僵菌属近缘种的分类难题。Drive和Milner(2000)根据绿僵菌ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列构建系统发育树结果，将37株绿僵菌同样划分为3个种(金龟子绿僵菌、黄绿绿僵菌和白色绿僵菌)，其中，黄绿绿僵菌下分5个变种，黄绿绿僵菌瘿绵蚜变种M.flavoviridevar.pemphigi(Driver & R.J. Milner) Kepler被首次定名。Kepler等(2014)认为仅仅以ITS来分析绿僵菌的系统发育非常有限，不能有效区分绿僵菌的近缘种，他采用EF-1α，RPB1，RPB2和β-tubulin多基因进化的方法结合形态学特征对绿僵菌及其近缘种进行了研究，认为黄绿绿僵菌瘿绵蚜变种与Metarhiziumpemphigi应为同物异名，随即取消了黄绿绿僵菌瘿绵蚜变种，改为Metarhiziumpemphigi(Driver & R.J. Milner) Kepler。Nishi等(2017)根据形态学特征及PCR-RFLP和多基因的系统分析的结果，同样认为应将黄绿绿僵菌瘿绵蚜变种改为Metarhiziumpemphigi。本文中qc1401菌株为蛴螬即弧丽金龟(Popilliasp.)幼虫僵虫上分离得到，该种曾被鉴定为黄绿绿僵菌瘿绵蚜变种Metarhiziumflavoviridevar.pemphigi(张亚波等， 2015)，后因黄绿绿僵菌及其近缘种的重新划分，本文中对该菌株重新定名为Metarhiziumpemphigi。本研究中的菌株WP08、WTKH和LV2的孢子颜色和形态上相近，而在构建的系统进化树中划分两个组群，菌株WP08、WTKH聚在平沙绿僵菌分支上，LV2聚在金龟子绿僵菌的分支上。WTKH最初被鉴定为金龟子绿僵菌，本文依据形态学和EF-1α基因序列分析将其重新鉴定为平沙绿僵菌。

松材线虫病是松树(Pinusspp.)的一种毁灭性病害，松褐天牛是病原线虫的主要媒介昆虫。羽化的松褐天牛有20%～30%携带有松材线虫，羽化10天后松材线虫开始转移到寄主体内，转移期可以持续79天(Lietal., 2007)。蒋平等(2002)研究表明，线虫的脱出数量在松褐天牛成虫羽化后20～30天最多，前10天传播的数量不到总量的10%。而最早产卵时间为补充营养后的第8天即羽化后第8天，说明在成虫羽化后14天内杀死松褐天牛，才能对控制松材线虫病有明显效果。王四宝等(2004)和何学友等(2005)室内毒力测定的结果表明，松褐天牛成虫感染金龟子绿僵菌后第7天就开始死亡，10～15天为死亡高峰期； 而本试验中供试的平沙绿僵菌WP08菌株浸虫法的LT50为5.52天，5～10天为死亡高峰期，浸枝法的LT50为11.38天，10～15天为死亡高峰期； 金龟子绿僵菌LV2菌株的致病速度也较快，浸虫法LT50为10.38天，10～15天为死亡高峰期，均具有较大实际应用价值。

在相同环境条件下，昆虫接触到的病原菌越多，其被感染的几率越大。本试验中采用了3种施菌方法，浸虫法使虫体接触到的孢子数量最多，故杀虫效果最好，其次为浸枝法，而无纺布法孢子数量相对较少，其杀虫效果较差。通常在林间使用喷雾、喷粉法防治森林蛀干害虫，真菌孢子很难接触到树干内的幼虫，而且对羽化不整齐的天牛成虫效果常不理想，难以完全发挥优良菌株的效果与作用，这是蛀干害虫防治中的难题。无纺布法可以延长孢子在林间的扩散时间，在这方面的研究取得了一些进展(Tsutsumietal.， 1997； Okitsuetal., 2000； 王滨等， 2003)。本试验中的无纺布法能够说明孢子的飘移是能够增加天牛成虫的感染机会，后期还可以结合天牛的趋性特点选择相应的无纺布颜色开展林间试验。针对成虫开展致病力强的优良菌株选育并开发相应的施菌技术，以提高其在天牛等蛀干类害虫防治中的应用价值。

4 结论

平沙绿僵菌WP08菌株对松褐天牛致死率高、致死速度快，为防治松褐天牛的优良菌株。孢子浓度是影响防效的关键因素，林间应用时，建议绿僵菌孢子浓度应在1×108个·mL-1以上。此外，可采用喷施绿僵菌孢子悬浮液或悬挂无纺布法防治松褐天牛成虫。