反复种植失败相关非编码RNA的功能及其研究进展

陈仝，杨晓葵

反复种植失败（recurrent implantation failure，RIF）是体外受精-胚胎移植（in vitro fertilizationembryo transfer，IVF-ET）成功率进一步提高的关键因素之一，目前国内外尚无统一诊断标准，主要是指在2个或以上的新鲜或冷冻周期内，共移植至少4个优质卵裂期胚胎或不少于2个囊胚后仍未获临床妊娠[1]。胚胎着床取决于良好的子宫内膜容受性、高质量胚胎及两者相互作用。RIF原因复杂，随着分子生物学技术的发展，目前研究热点聚焦于胚胎植入过程中子宫内膜容受性与胚胎发育的分子层面。近年来，基因芯片技术检测显示mRNA和非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）的差异表达可影响子宫内膜容受性及胚胎植入，从而在RIF的发生中发挥生物学作用。现就ncRNA在RIF方面的研究进展进行综述。

1 ncRNA的生物学特点

ncRNA是一类不直接参与蛋白质编码的RNA分子，但其并非无生物学功能，可参与mRNAs剪接、表观遗传控制、启动子特异性基因调控、X染色体失活、核结构维持等多种生理及病理过程[2]。根据ncRNA形状可将其分为线性RNA及环状RNA（circular RNA,circRNA）两类，线性RNA又可根据长度分为以下两类：①长度小于200个核苷酸的短链ncRNA，包括核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）、转运RNA（transfer RNA，tRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）、与Piwi蛋白相作用的RNA（PIWI interacting RNA，piRNA）、小核仁RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）等；②长度大于200个核苷酸的长链ncRNA（long non-coding RNA，lncRNA）[2-3]。随着测序技术发展和研究的深入，微小RNA（miRNA）、lncRNA和circRNA等在细胞中的作用越来越受到关注，这些ncRNA可以通过影响子宫内膜中黏附分子、细胞因子的表达等调控子宫内膜容受性，参与卵母细胞有丝分裂、细胞增殖、发育等多种生物学过程影响胚胎质量和胚胎与子宫内膜相互作用，从多个环节导致RIF的发生。

2 miRNA与RIF

2.1 miRNA对子宫内膜容受性的调控子宫内膜容受性是指着床期子宫内膜获得介导胚胎着床的能力，月经周期中允许发育正常的胚胎黏附并侵入子宫内膜的时间段称为种植窗，约在排卵后7～10 d，在此期间，发育同步的胚胎和子宫内膜通过相互作用使胚胎成功着床[4]。miRNA可通过调控转录因子及细胞因子表达影响子宫内膜容受性，导致RIF的发生。在着床前后，白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）的高表达可提高子宫内膜容受性，与野生型小鼠相比，敲除miR-30d或使用miRNA激动剂上调miR-223-3p均可降低子宫内膜组织中LIF的表达，从而抑制胚胎着床[5-6]。同源盒基因A10（homeobox A10，HOXA10）是调节子宫内膜容受性的重要分子，其正常表达是胚胎种植所必需的[7]。人子宫内膜间质细胞中过量的miR-139-5p可抑制HOXA10的表达，对胚胎种植产生不利影响[8]。Kresowik等[9]关于已生育女性子宫内膜的研究发现，miR-31在种植窗期子宫内膜组织和血清中均显著高表达。这些研究表明，miRNA不仅可通过调节LIF、HOXA10等着床关键分子的表达影响子宫内膜容受性，导致RIF发生，也可作为潜在的子宫内膜容受性评价的生物标志物。

2.2 miRNA对胚胎种植的影响miRNA除调节子宫内膜容受性外，还可通过各种信号转导途径影响子宫内膜和胚胎之间的相互作用。正常小鼠的子宫内膜组织中miR-429在胚胎种植过程中表达下降，miR-429表达增加可通过抑制原钙黏蛋白8而抑制细胞的迁移和侵袭能力，导致植入位点减少，从而影响胚胎植入[10]。而miR-126-3p在小鼠子宫内膜植入位点特异性上调，可通过上调整合素（integrin,ITG）α11的表达促进细胞迁移和侵袭能力，在胚胎种植中起到重要作用[11]。基质金属蛋白酶26（matrix metalloproteinase 26，MMP26）是一种参与细胞外基质降解的MMPs家族成员，研究发现小鼠子宫内膜中miR-125b表达水平的增加可通过抑制MMP26的表达来影响细胞运动并阻碍胚胎着床[12]。有研究表明RIF患者子宫内膜组织中高表达的miR-145，通过抑制子宫内膜上皮细胞（endometrial epithelium cells,EECs）中有利于细胞表面黏附的胰岛素样生长因子1型受体（insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R）而抑制胚胎附着，这可能是RIF发生的潜在分子机制[13]。

胚胎的成功种植与胚胎质量关系密切。目前，可移植胚胎的选择主要基于形态学评估，然而简单的形态学方法不足以预测胚胎质量。研究表明miRNA表达水平与卵母细胞质量及胚胎质量有关。Feng等[14]研究显示，发育成优质胚胎的人卵母细胞的卵泡液中miR-320呈高表达，动物实验表明在小鼠卵母细胞中敲除miR-320，可通过Wnt信号传导对胚胎发育潜能产生负面影响。猪卵母细胞中，下调的miR-29b通过介导DNA甲基化，上调凋亡基因Bax和Caspase-3表达，导致囊胚质量下降，提示miR-29b可能在胚胎发育中起到保护作用[15]。未发育成囊胚的牛的条件培养基中，miR-24、miR-191和miR-148A表达均显著上调，添加miR-24类似物后可明显缩短桑葚胚发育到囊胚期的时间[16]。

上述研究表明，miRNA可调节细胞黏附及侵袭相关因子表达，影响胚胎与子宫内膜间的相互作用，并通过参与DNA甲基化、细胞凋亡等途径调控干扰卵母细胞及胚胎发育，进而影响胚胎种植，导致RIF的发生。

3 lncRNA与RIF

与正常可妊娠女性相比，RIF患者子宫内膜组织、卵母细胞及其周围卵丘细胞中存在着大量差异表达的lncRNA。这些lncRNA可参与调节免疫活性、细胞黏附、细胞凋亡、染色质重塑等多种途径影响子宫内膜容受性、胚胎与子宫内膜间的相互作用及胚胎质量，在RIF的发生中发挥重要作用。

3.1 lncRNA对子宫内膜容受性的调控RIF患者与ET后成功妊娠女性的种植窗期子宫内膜组织中存在多种差异表达的lncRNA，生物信息学分析显示NONHSAT083203.2、NONHSAT212577.1和NONHSAT 193031.1等lncRNA通过lncRNA-mRNA相互作用调节细胞黏附、细胞增殖与凋亡、生长因子表达及免疫活性影响子宫内膜血管生成和对类固醇类激素的反应，从而影响子宫内膜容受性，参与RIF的发生[17-18]。Xu等[19]通过分析RIF患者子宫内膜细胞的lncRNAmiRNA-mRNA 网 络，发 现lncRNA（TRG-AS1、SIMM25、NEAT1、LNC00511、SLC26A4-AS1 和H19）通过参与免疫反应、代谢过程和细胞周期调控等多种途径影响子宫内膜容受性，在RIF的发生中发挥作用，但具体机制仍需进一步研究证实。

3.2 lncRNA对胚胎种植的影响lncRNA可通过调节ITG家族的表达参与调控胚胎与子宫内膜间相互作用。研究发现RIF患者子宫内膜组织中lncRNA H19与ITGβ3的表达水平均降低且呈正相关，这种改变是lncRNA H19通过抑制let-7进而调控ITGβ3的表达引起的，提示lncRNA H19在胚胎种植中可能起到重要作用[20]。Li等[21]研究表明可妊娠女性的子宫内膜中，正常表达的lncRNA ENST00000433673可通过介导靶基因ITGAL提高细胞间黏附分子1的表达水平，进而促进胚胎的黏附和植入。

卵母细胞及其周围卵丘细胞中差异表达的lncRNA与卵母细胞质量、胚胎发育潜能及胚胎质量有关。AK124742是PSMD6基因的一个反义lncRNA，在发育成优质胚胎的卵母细胞外周的人卵丘细胞中，AK124742和PSMD6的表达水平上调且呈正相关，而且妊娠组AK124742和PSMD6的表达水平明显高于非妊娠组[22]。Bouckenheimer等[23]应用RNA-seq技术检测人MⅡ卵母细胞及卵丘细胞中显著表达的lncRNA并构建lncRNA-mRNA共表达网络预测其功能，结果显示MⅡ卵母细胞显著表达的lncRNA（BCAR4、C3orf56、Tunar、OOEP-AS1、CASC18 和LINC01118）可能参与染色质重塑、细胞多能性及推动早期胚胎发育，而卵丘细胞中显著表达的lncRNA（NEAT1、MALAT1、ANXA2P2、MEG3、IL6STP1 和VIM-AS1）与凋亡相关基因和细胞外基质相关功能基因表达相关。这表明多种lncRNA可参与卵母细胞与卵丘细胞间的相互作用影响胚胎发育。

4 circRNA与RIF

4.1 circRNA对子宫内膜容受性的调控目前对circRNA在子宫内膜容受性中作用的研究仍处于初步探索阶段。但已发现多种显著差异表达的circRNA参与子宫内膜容受性的调控。Liu等[24]通过circRNA微阵列技术和实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）发现并验证了在RIF患者子宫内膜中hsa-circRNA-103716、hsa-circRNA-070616、hsacircRNA-104854、has-circRNA-104001、has-circRNA-004183、has-circRNA-044353和hsa-circRNA-404686这7个显著差异表达的circRNA。另有动物研究发现，circRNA-9119通过降低miR-26a水平下调羊子宫内膜上皮细胞中前列腺素内过氧化物合酶2的表达，影响LIF和血管内皮生长因子（VEGF）等细胞因子水平从而调节子宫内膜容受性[25]。

4.2 circRNA对胚胎种植的影响circRNA在胚胎与子宫内膜相互作用及胚胎质量中的研究也逐步开展。circRNA可通过与miRNA竞争mRNA的非编码区，对mRNA表达进行调控，即为miRNA海绵。circRNA8073可作为miRNA海绵降低miR-181a的水平，从而增加羊EECs中神经降压素的表达，抑制EECs凋亡，并诱导LIF、VEGF、HOXA10和环氧合酶2的表达，有利于胚胎种植[26]。Zhang等[27]利用微阵列技术检测了早孕小鼠子宫内膜组织中着床点和未着床点的circRNA表达谱，结果显示，与未植入部位相比，植入部位有101个circRNA上调，75个circRNA下调，差异表达的circRNA与细胞连接、滋养层细胞黏附与侵袭等胚胎种植因素有关。

circRNA在胚胎早期发育中是必不可少的，异常表达可能会影响胚胎质量导致胚胎种植失败。在猪卵母细胞中敲除circARMC4可导致染色体排列严重受损，并显著抑制第一极体排出和早期胚胎发育[28]。Cheng等[29]应用基因芯片技术分析了≤30岁和≥38岁女性颗粒细胞中circRNA的表达，差异表达的circRNA_103827和circRNA_104816参与葡萄糖代谢、细胞有丝分裂和卵巢类固醇的生成，可反映卵泡微环境受损的情况，其表达水平与女性年龄呈正相关而与优质胚胎数呈负相关。两者在胚胎种植中的作用仍需更多研究去证实。

5 结语与展望

ncRNA可通过调节生长因子表达、血管增生、细胞凋亡、细胞连接、滋养层细胞侵袭和类固醇类激素调控等多种途径参与子宫内膜容受性、胚胎与子宫内膜同步发育和胚胎发育的调控。目前有关lncRNA及circRNA在RIF中的研究大多数处于差异表达检测阶段，差异表达分子影响子宫内膜容受性及胚胎种植的具体机制仍需进一步研究。通过深入了解ncRNA调控子宫内膜容受性及胚胎种植的机制，有望找寻提高不孕患者胚胎种植率的方法，以期早日突破RIF这一辅助生殖技术中的瓶颈问题。