松果体素在辅助生殖技术中的研究进展

谢庆娥，王梦瑶，梁谭，刘雅静

松果体素（melatonin）又称褪黑素，是美国耶鲁大学Lerner教授于1958年从牛松果体提取物中分离纯化出的一种能够使青蛙皮肤褪色的物质，其不仅可以通过与其高亲和性跨膜受体及核内受体结合发挥一系列生物学效应，也可以通过直接清除活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）或激活抗氧化酶从而发挥独特的抗氧化作用，从而在很多生理活动和病理过程中发挥重要作用[1]，主要包括改善睡眠[2]、调节生物钟[3]、延缓衰老[4]、抗氧化[5]、抗炎和免疫调节[6]、改善记忆及抗肿瘤[7]等。

辅助生殖技术（assisted reproductive technique，ART）是目前治疗不孕不育的主要有效手段。ART过程中，不论是体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）还是胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）均不能模拟真实的体内生理条件，ROS可能来源于细胞内或者细胞外等各个环节。体外培养环境下，一种或多种因素均可能导致氧化应激的产生，加速卵母细胞老化，降低卵母细胞质量，影响卵母细胞的发育潜能，继而影响胚胎着床，从而影响ART的治疗结局。近年来，由于松果体素独特的抗氧化作用，具有的高亲水性和高脂溶性使其容易通过生理屏障进入各类细胞，松果体素在ART中的应用极大地引起了研究者的关注。

1 松果体素的合成与代谢

松果体素主要是由松果体腺细胞分泌的一种神经内分泌激素，化学名称为N-乙酰-5-甲氧色胺（N-acetyl-5-methoxytryptamine）。松果体素以色氨酸（tryptaphan，Trp）为合成原料，经过羟化、脱羧、N-乙酰化和氧甲基化，最终形成松果体素。其具体过程如下：Trp 在色氨酸羟化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）的作用下羟化为5-羟色氨酸（5-hydroxytryptophan）。5-羟色氨酸经过芳香氨基酸脱羧酶的作用转化为5-羟色胺（5-HT），后者在N-乙酰基转移酶（serotonin N-acetyltransferase，NAT）的作用下经过N-乙酰化形成N-乙酰基-5-羟色胺（NAS），此过程是松果体素合成的关键步骤。最后在羟基吲哚甲基化转移酶（hydroxyindole -O -methyltransferase，HIOMT，又 称Acetylserotonin Omethyltransferase，ASMT）的作用下通过氧甲基化将NAS转化为松果体素。松果体素合成后并不在松果体中储存，随即被动地进入血液循环[1]。

松果体素的分解代谢主要在肝脏和脑组织中进行，其中肝脏是松果体素的主要降解途径。在肝细胞中，松果体素在微粒体羟化酶作用下生成6-羟松果体素（6-OH-melatonin），从而丧失生物活性[8]。松果体素在脑组织的代谢主要通过氧化作用，松果体素的吡咯核环打开形成N-乙酰-5-甲氧-犬尿胺[9]。松果体素的代谢产物主要通过尿液排出。

2 松果体素的来源

有研究表明，除松果体外，其他组织和细胞也可以产生松果体素，包括视网膜、肝脏、小脑、气道上皮、肾脏、肾上腺、甲状腺、卵巢、胎盘、子宫内膜、哈德氏腺、胃肠道和皮肤、肥大细胞、内皮细胞、骨髓干细胞、淋巴细胞、血小板，甚至胆汁和人类卵泡液、精液中也存在高水平的松果体素[10]。本课题组前期研究发现，体外培养的大鼠原代皮层星形胶质细胞、星形胶质瘤细胞系C6以及小鼠成纤维细胞NIH3T3等均可合成和分泌松果体素[11]，并且载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）的基因型对星形胶质细胞分泌的松果体素的功能有不同的调节作用[12]。动物实验结果表明，生殖系统的卵母细胞、睾丸间质细胞、精母细胞、精子细胞等均可合成松果体素[13]。线粒体作为卵母细胞提供能量的主要细胞器，也是卵母细胞成熟过程产生松果体素的主要场所[14-15]。另有研究发现，松果体素在原始卵泡和闭锁卵泡弱表达[10]，多囊卵巢综合征患者的卵巢颗粒细胞和卵丘-卵母细胞复合体也能分泌一定量的松果体素[16]。人类下丘脑-垂体-性腺轴3个水平均可表达松果体素受体，表明松果体素可能在这些组织和细胞中发挥重要作用。

3 松果体素的抗氧化作用

松果体素是一种非酶类抗氧化物质，具有高亲水性和高脂溶性，很容易通过各种生理屏障进入不同组织细胞中，并在线粒体和细胞核中富集。松果体素可以多系统、多靶点地作用于中枢神经系统、心血管系统、免疫系统、内分泌系统和生殖系统等，发挥多种生物学效应。松果体素可以通过两种方式发挥抗氧化保护作用，一种是通过其高亲和性的跨膜受体和核内受体对特定的细胞发挥保护作用；另外，松果体素可以直接通过其抗氧化作用发挥保护作用。

松果体素及其经过肝脏代谢形成的代谢产物6-羟松果体素均具有很高的抗氧化能力，松果体素所产生的抗氧化级联反应使其成为高效、独特的抗氧化剂。研究发现，松果体素能够激活细胞中的抗氧化酶，包括超氧化歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶等，抑制促氧化酶，保护细胞和线粒体免受ROS的侵害，从而抑制细胞凋亡[9,17]。松果体素还能通过细胞沉默信息调节蛋白1（silent information regulator 1，SIRT1）依赖性的机制抑制小鼠间质细胞的凋亡和氧化应激[18]。松果体素对组织细胞的抗氧化保护作用一直是研究的热点。动物实验发现，长期给予松果体素可以减轻大鼠卵巢组织由酒精引起的氧化应激损伤[19]。哺乳动物的卵子和胚胎对氧化应激损伤非常敏感，研究表明，松果体素可以通过其抗氧化效应减轻小鼠卵巢线粒体的氧化应激损伤，改善衰老引起的小鼠生育力下降[20]。此外，松果体素还可通过抗氧化效应维持小鼠颗粒细胞膜的完整性[21]，并通过与颗粒细胞上的特异性受体结合，激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），调节颗粒细胞黄体生成激素（LH）受体和促性腺激素释放激素受体基因的表达及卵巢功能[22]。

4 松果体素在ART中对卵母细胞、卵巢颗粒细胞和胚胎的保护作用

ART技术的关键因素之一是配子和胚胎的质量，而卵母细胞和胚胎的退化和死亡是影响ART成功率最关键的因素。卵巢颗粒细胞是卵巢的主要功能细胞，其增殖与分化直接影响卵泡的发育、排卵、黄体形成及性激素分泌等，在卵母细胞成熟过程中起着重要的调控作用，最终会影响胚胎的发育潜能[4，23]。研究发现卵巢颗粒细胞凋亡与IVF的成功密切相关，其可预测卵母细胞质量和IVF-ET的成功率，并可作为胚胎发育的依据[23]。

松果体素对卵母细胞、卵巢颗粒细胞及胚胎的发育都有一定的保护作用。研究表明，外源性松果体素可抑制未成熟卵母细胞凋亡并促进其成熟，提高卵母细胞质量，改善胚胎的发育[24-25]。另外，松果体素可以通过膜受体MT1和MT2抑制卵巢颗粒细胞凋亡，促进孕酮的产生[26]。

在常规的ART超促排卵周期中，未成熟卵母细胞的比例约为15%～20%，这些细胞通常是被废弃的。研究表明，通过未成熟卵母细胞体外成熟（in vitro maturation，IVM）技术，松果体素可以通过增强网格蛋白介导的内吞作用促进未成熟卵母细胞发育成熟，提高囊胚形成率和早期胚胎发育潜能，形成优质胚胎[27]。最近的研究发现，松果体素可以通过改善线粒体功能促进控制性超促排卵（COH）周期中人未成熟卵母细胞体外发育成熟和胚胎发育[28]。单细胞转录组测序结果显示，正常对照组和松果体素处理组之间有1 026个差异表达基因（differential genes，DEGs），松果体素处理组中大多数参与氧化磷酸化途径并与三磷酸腺苷（ATP）生成相关的DEGs表达上调。另外，松果体素处理组卵母细胞线粒体膜电位明显升高，细胞内ROS和Ca2+水平明显下降。

有研究发现，卵泡液中松果体素的浓度显著高于外周血，并且大卵泡（卵泡发育后期）液中的松果体素水平明显高于小卵泡（卵泡发育早期），提示松果体素在卵母细胞发育和成熟过程中起重要作用[29]。此外，卵泡液中的松果体素不仅与卵子的数量和质量相关，并可作为预测卵巢储备功能和IVF-ET结局的生物标志物[29]。本课题组的近期研究表明，松果体素可以通过抑制钙离子的内流维持人卵母细胞的线粒体膜电位，对未成熟卵母细胞起保护作用[30]。

5 松果体素在ART中对精子的保护作用

研究发现，松果体素受体在男性的下丘脑视上核、垂体及睾丸均有表达。松果体素可通过下丘脑-垂体-睾丸轴调控垂体促性腺激素的分泌，从而影响生殖系统的功能。松果体素也能与睾丸的β肾上腺素受体结合，直接调控卵泡刺激素（FSH）、LH、睾酮（T）和前列腺素（PG）等性激素的分泌，进而调控生殖器官的发育成熟[10]。

一定水平的ROS在精子的获能、顶体反应、精卵融合及高活跃性运动等生理过程中发挥重要作用。然而，过多的ROS则可使精子膜发生脂质过氧化级联反应，产生丙二醛（MDA）等脂质过氧化终产物，导致精子膜结构与功能的损伤。研究表明，精子膜上富含多聚不饱和脂肪酸，非常容易受ROS攻击，可改变精子膜流动性，继而导致精子运动能力减弱甚至丧失。在正常生理情况下，精子和精浆中均含有可清除ROS的抗氧化物质，可以保护精子免受ROS的攻击和损伤。然而，在一些病理或特殊情况下，ROS的过度生成超出了精子中抗氧化物质的清除能力，引起精子结构和功能的损伤。

ART操作过程中，ROS可产生于精子制备的多个环节如精液离心过程中的未成熟精子、精浆中的抗氧化剂丢失或白细胞污染等均可导致ROS生成。同时，ART操作过程中的外环境也可能成为氧化应激的潜在来源。与体内正常的生理环境相比，体外处理的精子处于相对高氧的环境，可能影响精子质量及胚胎的发育潜能。

线粒体是精子运动的能量来源，其结构与功能的改变必然会影响精子的运动能力，导致精子质量下降。琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）是三羧酸循环的关键酶之一，位于线粒体内。研究发现，SDH活性和线粒体膜电位的改变是ROS引起精子线粒体功能损伤的主要原因，而松果体素则可以通过其独特的抗氧化能力对该损伤起到很好的保护作用[31]。

有文献报道，精液中存在松果体素并与精子活力有关，大部分男性不育患者的精液中均发现ROS水平升高[10]。研究证实，松果体素对牛和公鸡解冻后的精子质量有一定的保护作用[32-33]。松果体素可通过减少生殖细胞凋亡和调节睾酮水平改善尼古丁处理大鼠精子生成和精子染色质的完整性[34]。另外，松果体素可通过磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信号通路影响精子膜的完整性、细胞内活性氧种类、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3）活性等，对人类精子冷冻保存过程中的低温损伤具有很好的保护作用[35]。

6 结语

卵母细胞和胚胎的退化和死亡是影响ART成功率最关键的因素，而卵巢颗粒细胞凋亡影响卵母细胞成熟和胚胎发育潜能。由于松果体素具有高亲水性、高脂溶性以及抗氧化效应，其可以保护卵母细胞、卵巢颗粒细胞、精子和胚胎免受ROS介导的氧化应激损伤和细胞凋亡，同时松果体素具有安全性高、毒性低的特点，其在辅助生殖领域将会有广泛的应用前景。