卵巢衰老相关非编码RNA的研究进展

柏林，杨晓葵

卵巢衰老是指女性卵巢储备功能逐渐衰退直至衰竭的过程，表现为卵泡数量减少和卵母细胞质量下降，从而影响卵巢内分泌功能和生育能力。卵巢衰老受年龄、遗传、免疫、医源性、社会环境等多因素影响，包括生理性卵巢衰老和病理性卵巢衰老[1]。生理性卵巢衰老是受年龄影响卵巢功能自然老化的过程。卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）、早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）等是病理性卵巢衰老。随着分子技术的发展，卵巢衰老分子机制的研究不断深入，涉及基因突变、细胞凋亡、氧化应激等方面，其中非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）作为功能性RNA分子，在卵巢细胞分化、增殖、凋亡中发挥重要作用，为研究卵巢衰老提供了新的思路。

1 ncRNA概述

ncRNA是指不编码蛋白质的功能性RNA分子，人类基因组中只有1.5%的序列能编码蛋白质，有多达80%的基因组序列为ncRNA，不参与蛋白质的翻译[2]。ncRNA作为介导细胞调控的功能性分子，参与细胞信号传导通路，影响细胞分化、增殖、凋亡等过程，在生长发育、疾病发生及发展中起着重要的调节作用。根据其功能特点，ncRNA分为两类：管家ncRNA（housekeeping ncRNA）和调节ncRNA（regulatory ncRNA）。管家ncRNA在所有细胞中均表达，维持细胞基本功能，主要包括核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）、核小RNA（snRNA）和核仁小RNA（snoRNA）等。调节ncRNA在基因表观遗传、转录及转录后水平参与调控，主要包括长链ncRNA（lncRNA）、 微 小RNA （miRNA）、 环 状RNA（circRNA）、小干扰RNA（siRNA）和piRNA（piwiinteracting RNA）等[3]。

2 ncRNA与卵巢功能

卵巢内的miRNA、lncRNA和circRNA等非编码RNA可通过调控其相应的靶基因和信号转导通路影响卵泡发育、排卵与闭锁，并参与卵巢局部激素的合成与分泌。

2.1 ncRNA对卵泡发育的调控卵巢细胞中存在的多种ncRNA参与卵泡募集、选择、排卵等过程。Sontakke等[4]通过牛卵泡发育miRNA微阵列研究发现miRNA参与优势卵泡的选择，优势卵泡中btamiR-144、bta-miR-202、bta-miR-451、bta-miR-652和bta-miR-873的表达高于小卵泡。另有研究发现在排卵障碍女性血清中miR-200b 和miR-429表达水平更高，应用外源性促性腺激素促排卵治疗后可使二者水平下降至正常排卵女性水平[5]。抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）通过结合AMH受体Ⅱ型（Amhr2）在卵泡生长发育中发挥重要作用，而lncRNA-Amhr2可增加Amhr2启动子活性，激活其在小鼠卵巢颗粒细胞中的表达[6]。Bouckenheimer等[7]发现人MⅡ期卵母细胞中高表达的lncRNA BCAR4、C3orf56、TUNAR、OOEP-AS1、LINC01118和CASC18，参与染色质重构、细胞多能性和早期胚胎发育，卵丘细 胞 中 的lncRNA MEG3、MALAT1、TUG1、MIAT、PANDAR 和PVT1参与调控卵泡发育早期细胞骨架形成和细胞间黏附。

circRNA在卵母细胞成熟中发挥重要作用。circARMC4调控猪卵母细胞减数分裂成熟和早期胚胎发育，卵丘细胞中特异性表达的circRICTOR下调会导致卵丘扩大失败，影响卵母细胞成熟和胚胎发育[8]。骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15，BMP15）和生长分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF9）是卵母细胞分泌的两种生长因子，二者可通过circ_n/a_75调节miR-339a，circ_n/a_303调节miR-2400和miR-30c，抑制相应基因表达，影响猪卵泡发育和卵母细胞成熟[9]。

2.2 ncRNA与卵巢激素合成ncRNA不仅能调节卵泡发育，还能影响激素合成与分泌以及黄体形成。miR-7a2的遗传缺失会导致雌性小鼠不育、促性腺激素和类固醇激素水平降低，miR-7a2通过对垂体前列腺素和BMP4信号通路的影响，调控卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）和黄体生成激素（luteinizing hormone，LH）的合成和分泌[10]。一项研究通过对牛卵泡和黄体组织进行微阵列分析发现miR-96通过靶向作用于叉头转录因子1（forkhead box O1，FOXO1）介导黄体发育和孕酮生成[11]。miR-210可通过下调芳香化酶基因Cyp19a1、增殖细胞核抗原基因（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和癌基因HRas抑制水牛卵巢颗粒细胞的增殖，抑制EFNA3（ephrin A3）表达促进血管生成，为颗粒细胞分化和黄素化做准备[12]。

lncRNA H19的缺失会阻断小鼠卵巢中类固醇合成快速调节蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，STAR）的产生，影响孕激素的合成[13]。lncRNA类固醇受体RNA激活剂（lncRNA steroid receptor RNA activator，lncRNA SRA）上调可促进小鼠颗粒细胞增殖，抑制颗粒细胞凋亡，促进雌二醇和孕酮的分泌[14]。circRNA表皮生长因子受体（circRNA epidermal growth factor receptor，circEGFR）的过表达可增加小鼠雌二醇合成和颗粒细胞生长，circEGFR的缺失则促进了孕酮产生并抑制颗粒细胞分泌雌二醇[15]。

3 ncRNA与卵巢衰老

始基卵泡池大小及卵泡消耗速度决定了生殖寿命的长短。卵巢衰老主要表现为卵泡数量减少和卵母细胞质量下降，发生机制尚不明确。任何影响卵泡池大小、加速卵泡闭锁的因素都会影响女性的卵巢储备功能。卵巢内的miRNA、lncRNA和circRNA等非编码RNA可通过影响卵泡发育与闭锁、卵巢局部激素的合成与分泌等参与和调控卵巢衰老的发生。

3.1 ncRNA和卵泡发育与闭锁卵巢衰老的主要表现之一是卵巢内卵泡数目减少，可能由卵泡发育障碍与闭锁加速导致。ncRNA参与调控卵泡发育和卵泡退化加速。选择性敲除小鼠颗粒细胞中核糖核酸酶Dicer1后，成熟的miRNA无法形成，卵泡发育相关的抗苗勒管激素（Amh）、抑制素βA亚基（Inhba）、细胞色素P450c17α（Cyp17a1）、Cyp19a1、Gdf9、Bmp15等基因呈差异性表达，多种因素导致始基卵泡池消耗增加，早期卵泡募集[16]。miR-17-92簇是卵母细胞形成的重要调控因子，雌性小鼠生殖细胞中miR-17-92簇的缺失会使卵母细胞退化和卵泡闭锁增加[17]。miR-106a下调作用于凋亡信号调节激酶1基因（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1），可降低人卵巢颗粒细胞发育能力，引起颗粒细胞凋亡[18]。

POF是一种病理性卵巢衰老，是指年龄不到40岁的女性，出现持续闭经至少6个月，血清FSH水平＞40 IU/L，还伴有一系列低雌激素症状。在POF患者的血浆和卵巢颗粒细胞中miR-23a和miR-27a呈高表达，miR-23a和miR-27a可靶向作用于SMAD5并通过凋亡相关因子配体-凋亡相关因子（FasL-Fas）通路调控人颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁[19-20]。多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是卵巢内分泌疾病的另一种状态，双侧卵巢有较多的小卵泡，呈多囊样改变。与POF患者不同，PCOS卵巢颗粒细胞中miR-23a表达水平明显低于卵巢储备正常女性；miR-27a-3p可通过靶向环磷腺苷效应元件结合蛋白（cyclic AMP response element-binding protein 1，Creb1）抑制CYP19A1表达，促进颗粒细胞凋亡，抑制雌二醇的产生，参与PCOS的发生[21-22]。

多种miRNA通过调节下游信号传导参与了POF的发病。miR-181a在POF患者血液中显著上调，动物实验证明miR-181a通过下调激活素ⅡA型受体（activin receptor ⅡA，acvr2a）的表达来抑制激活素诱导的颗粒细胞增殖，在POF的发生中发挥重要作用[23]。Chen等[24]的研究表明POF患者血浆及卵巢颗粒细胞中高表达的miR-146a通过caspase级联途径下调白细胞介素1受体相关激酶（interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK1）和肿瘤坏死因子受体相关因子6 （tumor necrosis factor receptorassociated factor 6，TRAF6）促进颗粒细胞凋亡。

信号传导及转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）参与调控卵泡生长，应用小鼠POF模型研究发现miR-125a-5p可通过靶向于STAT3的3′未翻译区促进颗粒细胞凋亡[25]。在猪卵泡闭锁过程中结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）降低，同时miR-10a-5p上调，体外实验证明miR-10a-5p通过靶向与CTGF促进颗粒细胞凋亡，circINHA通过与miR-10a-5p竞争CTGF，可促进颗粒细胞增殖[26]。环磷酰胺可诱导小鼠卵巢萎缩，其机制是环磷酰胺通过激活lncRNAMeg3-p53-p66Shc，抑制小鼠颗粒细胞增殖，导致POF发生[27]。Zhao等[28]的研究显示在人卵巢组织和血清中lncRNA HOX转录反义RNA（lncRNA HOTAIR）的过表达可以上调Notch-1减少卵巢细胞凋亡从而改善POF。另有研究发现，与卵巢储备正常女性相比，生化性POI（biochemical POI，bPOI）患者颗粒细胞中存在133 个上调和424 个下调的circRNA，hsa_circ_003785、hsa_circ_103903和hsa_circ_008389有望作为bPOI的标志物，生物信息学研究结果显示差异性表达的基因富集在叉头转录因子（FOXO）信号通路，此通路参与颗粒细胞凋亡导致POI的发生[29]。

3.2 ncRNA与卵母细胞质量卵母细胞质量下降与DNA损伤修复失调、氧化应激和线粒体功能障碍等有密切关系，ncRNA在其中发挥了重要作用。

3.2.1 ncRNA与DNA损伤修复 共济失调毛细血管扩张突变基因（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）介导的DNA双链断裂修复途径在维持DNA完整性方面发挥着重要作用，其表达随衰老而显著减少，损伤的卵母细胞DNA因修复减少会影响卵母细胞质量。核糖核酸酶ⅢDrosha是参与miRNA加工和成熟的酶，其缺失会影响同源重组（homologous recombination，HR） 和非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ），减少DNA修复。Dang等[30]发现miR-379-5p在POI患者颗粒细胞中表达增加，miR-379-5p通过抑制DNA损伤修复基因PARP1和XRCC6的表达，抑制颗粒细胞增殖，损伤DNA修复功能，导致POI的发生。最近的一项研究发现POI患者颗粒细胞中lncRNA HCP5下调，lncRNA HCP5与Y-盒结合蛋白1（Y-box binding protein 1，YB1）结合调控错配修复基因MSH5（MutS Homolog-5）转录，破坏DNA损伤修复，导致颗粒细胞功能失调[31]。

3.2.2 ncRNA与氧化应激（oxidative stress） 活性氧（reactive oxygen species，ROS）是线粒体能量代谢的产物，能引起细胞损伤和衰老，人体中的抗氧化酶能及时清除ROS使机体维持稳态。然而随年龄增长，人体抗氧化酶的量和活性均降低，清除ROS能力下降，ROS在卵母细胞内累积会导致纺锤体不稳定、染色体异常和端粒缩短，影响卵母细胞的发育能力。Wang等[32]通过卵巢单细胞转录组谱发现在人颗粒细胞中抗氧化基因表达与年龄呈负相关，敲除抗氧化基因IDH1或NDUFDB10会引起氧化损伤。氧化应激是ROS在体内过量产生的一种现象，通过转录组测序技术（RNA-seq）分析显示，氧化应激使猪颗粒细胞中2 025个基因呈差异性表达，其中包括1 940种mRNA和55种miRNA，ssc-miR-424和ssc-miR-27b等在FOXO、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、Wnt（Wingless/Int）、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信号通路中丰富表达，可以调节细胞凋亡、细胞增殖、应激反应和激素分泌等过程[33]。沉默信息调节因子2相关酶1（sirtuin1，SIRT1）是一种氧化应激防御蛋白，可作为miR-93的调控靶点，通过消耗ROS维持细胞存活，miR-93上调可抑制SIRT1表达，导致氧化防御减少致使卵母细胞老化[34]。miR-93同样在PCOS患者颗粒细胞中高表达，通过靶向细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）影响颗粒细胞增殖导致卵泡发育紊乱[35]。

3.2.3 ncRNA与线粒体功能障碍 卵母细胞线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷贝数减少、突变率增加，引起电子传递链缺陷、能量代谢紊乱和膜电位改变，导致线粒体功能失调，卵母细胞质量下降。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是一种调控抗氧化基因表达的转录因子，牛卵巢颗粒细胞中miR-28、miR-153和miR-708的过表达会引起Nrf2的下调，造成ROS累积，损伤线粒体功能，减少颗粒细胞增殖[36]。miR-181a在过氧化氢处理的颗粒细胞和3-硝基丙酸诱导的卵巢氧化应激模型中上调，miR-181a 上调使SIRT1下调引起FOXO1乙酰化，FOXO1在氧化应激下通过加强凋亡相关因子配体（FasL）和促凋亡蛋白Bim（Bcl-2 interacting mediator of cell death）的表达引发颗粒细胞凋亡，并通过提高B细胞淋巴瘤/白血病-2基因相关蛋白X（Bcl-2 associated X protein，Bax） 与B 细 胞 淋 巴 瘤/白 血 病-2 基 因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的比例，激活凋亡效应蛋白Caspase-3，加速线粒体凋亡通路[37]。

3.3 ncRNA和激素合成与分泌卵巢衰老会引起内分泌失衡，出现月经改变、潮热出汗、激动易怒和性功能减退等围绝经症状，心血管疾病和骨质疏松等疾病的发生率显著增加。ncRNA通过调控卵巢相关激素的合成和分泌，参与卵巢衰老过程。

汉族POF患者血浆中miR-22-3p下调会引起FSH上升，动物实验也证实猪垂体前叶中可检测到miR-22-3p，用促性腺激素释放激素（gonadotropin releasing hormone，GnRH）处理猪下丘脑后，miR-22-3p明显下调，提示其可能参与垂体对FSH分泌的特异性调控[38]。使用miRNA-21-3p和miRNA-433抑制剂处理小鼠腺垂体前叶细胞后，可上调FSH β亚单位表达水平，导致FSH分泌增加[39]。随年龄增长，类固醇激素合成相关的基因下调，circRNA 103827和circRNA 104816在高龄女性颗粒细胞中上调，通过参与葡萄糖代谢和有丝分裂周期调控类固醇激素生成与卵泡微环境的恶化[40]。circDDX10-miR-1301-3p/miR-4660-SIRT3相互作用参与了卵巢衰老过程，circDDX10可能通过影响类固醇激素合成，参与卵巢衰老的调控[41]。

4 结语与展望

近年卵巢衰老引起的生育力下降引起广泛关注，POF和POI等病理性卵巢衰老严重危害女性生殖健康，针对卵巢衰老发生机制的研究，阐明各因素间的相互作用，是早发现、早治疗和改善女性生殖健康的关键，对提高女性生殖健康有重要的科学意义。研究发现，ncRNA在调控卵巢功能中发挥重要作用，通过调节卵泡发育与闭锁、卵巢局部激素的合成与分泌等过程参与卵巢衰老的发生，影响卵泡数量和卵母细胞质量。目前卵巢衰老的发生机制尚不明确，ncRNA在卵巢衰老中的调节机制有待进一步研究。随着科学技术的不断进步，有越来越多ncRNA及靶基因被发现，ncRNA将可能成为评估卵巢储备功能的新指标，其类似物或抑制剂将有可能用于调节卵巢衰老信号通路、干预生殖衰老过程。ncRNA在未来将揭示更多卵巢生理和病理调控机制，为卵巢衰老及其他卵巢功能障碍的发生和治疗提供新的视角。