卵巢储备功能减退的相关分子遗传学研究进展

陈海霞，白晓红

卵巢储备功能（ovarian reserve，OR）指卵巢皮质区卵泡生长发育并形成可受精卵母细胞的能力，此能力取决于卵巢储备始基卵泡的数量和质量。若卵巢内可募集的卵泡数量减少或卵母细胞质量下降，配子生成功能下降，可致生育能力下降，即为卵巢储备功能减退（diminished ovarian reserve，DOR）[1]。抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）和窦卵泡计数（antral follicle count，AFC）是与卵巢储备功能相关性最强的独立预测因素[2-4]。目前，由于延迟生育、二胎政策以及社会环境等因素，DOR患者所占比例日益增长，在不孕女性中占10%，发病率远高于早发性卵巢功能不全（primature ovarian insufficiency，POI）。DOR处于POI早期，无临床症状，只有生化水平的异常表现，是育龄期女性最常见的生殖内分泌疾病之一[5]。

目前，DOR的病因尚不明确，研究表明可能与遗传、自身免疫、感染、医源性损伤以及生活环境等因素有关。医源性因素通过仔细询问病史很容易获取。研究证实，手术治疗是导致后天DOR的重要因素[6]。年龄因素是公认的影响卵巢储备功能的另一个重要高危因素。由于年龄增长，卵泡的数量和质量下降，最终导致DOR[7]。因此，研究者将年龄导致的DOR视为生理性DOR，其他原因如免疫性、遗传性、特发性因素导致的DOR被认为是病理性DOR，因为它们反映了异常的卵巢衰老。生理性DOR和病理性DOR代表两种不同的患者群体。生理性DOR是无法抗拒的事实，在临床中要加以区分，以便选择不同的治疗方法。由于DOR具有不可逆性，目前尚无非常有效的方法恢复或者改善患者的卵巢功能，因此早发现、早干预是解决患者生育问题的有效途径。分子遗传学病因分析是实现病理性DOR人群早期筛查和早期诊治的关键手段之一，无论对临床治疗还是对早期预防都是非常重要的。

遗传因素是导致DOR的重要因素。目前，认为导致POI的脆性X智力低下基因1（FMR1）也是导致DOR的潜在基因之一[8]。此外，POI的一些已知遗传基因如叉头转录因子2（Foxl2）、生长分化因子9（Gdf-9）已经在小鼠中证实可能与DOR有关[9]，尽管POI的许多遗传原因已得到证实，但与DOR相关的致病基因却知之甚少，有关的研究更是不多。

总结梳理近年来国内外有关DOR的研究进展，对引起该疾病已报道的相关基因研究加以综述，最后阐述DOR与端粒长度的关系，以检查这些因素与DOR相关联的证据强度，以期为病理性DOR人群早期筛查和及早诊治提供理论依据，从而制定合理高效的治疗方案，避免无效治疗。根据引起DOR的基因是否引起其他疾病分为：综合性候选基因如FMR1、FOXL2等；非综合性候选基因如GDF-9、卵泡刺激素受体（FSHR）、雌激素α受体（ESR1）等。

1 综合性候选基因

1.1 FMR1FMR1又称家族性智力低下基因，位于该基因5′端CGG＞200的重复异常是导致脆性X综合征的常见原因。这种突变导致基因启动子区处于高甲基化状态，最终导致FMR1基因表达沉默。FMR1基因的CGG重复序列在人群中具有多态性。目前，国际上普遍认为：正常人群的CGG重复序列主要集中在29～30次，45～54次定义为中间带（inter-mediate），55～199次定义为前突变（pre-mutation），＞200次定义为全突变（full m′utation）。FMR1基因除与脆性X综合征有关，还与卵巢储备功能有关，是与POI、DOR相关的重要基因[8]。一项回顾性研究对62例DOR（无脆性X综合征史）患者的静脉血标本进行FMR1基因CGG重复序列检测，结果表明14.5%的DOR患者所携带的FMR1基因CGG重复序列在35～44[10]。携带中间带（35～54个CGG重复序列）的患者被视为处于“灰色区域”。有研究发现FMR1基因CGG重复序列处于灰色区域与DOR有关。一项前瞻性研究对DOR患者的血液标本进行FMR1基因CGG重复序列检测，发现14.5%的DOR患者携带的FMR1基因CGG重复序列为中间带，而在卵巢储备功能正常人群中仅3.9%携带[11]。另外，FMR1基因CGG重复序列还与卵泡刺激素（FSH）、AMH水平相关。Bishop等[12]通过检测卵巢储备功能正常和卵巢早衰（POF）患者血液中的FMR1基因CGG重复序列和FSH、AMH激素水平，统计分析FMR1基因CGG重复序列和FSH、AMH水平的相关性。结果表明FSH水平与FMR1基因CGG重复序列呈正相关（P＜0.01），AMH水平与FMR1基因CGG重复序列（＞32次）也呈负相关（P＜0.04）。其机制可能与FMR1基因mRNA过度堆积、脆性X智力低下蛋白（FMRP）相关mRNA调节异常、FMR polyG内含子泛素化调节、FMR1 基因组蛋白修饰改变等有关[13]。尽管有许多因素可能导致DOR，但许多特发性病例很可能具有遗传/表观遗传基础。FMR1基因突变（50～200个CGG重复序列）与POI的关系表明FMR1基因的表观遗传也可能成为DOR的危险因素。研究显示，和卵巢功能正常人群相比，DOR患者FMR1基因调控区域（包括启动子和外显子1）的组蛋白3赖氨酸9乙酰化（H3K9ac）和组蛋白3赖氨酸9乙酰化二甲基化（H3K9me2）表观遗传修饰更多，而组蛋白3赖氨酸9乙酰化三甲酰化（H3K9me3）修饰则没有差异[14]。目前大多数数据表明DOR与FMR1基因CGG重复序列有关。对这类人群进行FMR1基因筛查，有助于从基因角度为患者提供生育咨询。

1.2 FOXL2FOXL2是人类早期卵巢生成分化过程中的重要调控因子，通过转录调节作用，调节其靶基因转录及蛋白表达，同时参与颗粒细胞的增殖分化和类固醇的合成，对卵泡正常发育和维持正常的卵巢功能有重要作用。FOXL2是睑裂狭小、逆向内眦赘皮和上睑下垂综合征（BPES）的致病基因，分为两种亚型：Ⅰ型FOXL2突变产物是一种无功能的截断蛋白，由于突变FOXL2蛋白在叉头区或聚丙氨酸区前截断，产生的截断蛋白在叉头区完全或不完全缺失，导致眼睑发育异常并伴有POF；Ⅱ型FOXL2突变产物是一种延长蛋白，多由聚丙氨酸区的丙氨酸扩增产生。FOXL2突变产生截断蛋白，导致原始卵泡形成后卵母细胞周围的体细胞不能生长增殖，最终次级卵泡缺乏[15]。有研究用Cre/lox条件性基因敲除法，选择性地敲除了小鼠垂体前叶促性腺激素细胞中的Foxl2基因，条件性Foxl2基因敲除（CKO）的小鼠发育正常，但成年后生殖能力下降。CKO小鼠垂体中FSH β亚基mRNA表达量减少，导致FSH水平明显偏低。该实验提示Foxl2基因可能是体内FSH生成所必需的[16]。Foxl2基因对颗粒细胞分化、卵泡正常发育和维持正常的卵巢功能至关重要，并且具有抗卵泡凋亡的作用。Foxl2基因突变使颗粒细胞不能由扁平转为立方体，致使次级卵泡缺失，加速卵泡耗竭闭锁，导致卵巢内卵泡数目减少，最终发展为POI[16]。一例个案报道对POI患者外周血样本进行全外显子测序，发现其携带FOXL2基因突变[c.223C＞T（p.Leu75Phe）][17]。另外有研究发现，和卵巢储备正常人相比，POI患者卵巢组织中的FOXL2 mRNA表达水平偏低，差异有统计学意义（P=0.017），表明FOXL2表达水平低下可能是POI的致病因素[18]，提示该基因也可能是导致DOR的因素之一。

2 非综合性候选基因

2.1 GDF-9GDF-9是转化生长因子β（TGF-β）超家族成员之一，是卵母细胞产生的一种旁分泌因子，其对卵泡生成、颗粒细胞增殖至关重要。在卵巢组织中，GDF-9在卵母细胞中特定表达。除原始卵泡外，在所有卵泡发育时期均能检测到[19]。该因子构成复杂的旁分泌网络，介导卵母细胞和周围体细胞联系，促进初级卵泡向次级卵泡过渡，从而调控卵泡发育。Dong等[20]对Gdf-9基因敲除的小鼠卵巢进行了组织学实验，结果显示Gdf-9基因敲除的小鼠卵巢体积明显小于野生型小鼠，同时Gdf-9基因敲除小鼠的颗粒细胞形成异常，只能维持在单层状态，卵泡发育停滞于初级阶段，无法形成正常的卵泡，最终导致不孕。目前，多篇研究显示GDF-9的单核苷酸多态性（SNP）与DOR有关[21-22]。Wang等[21]研究发现GDF-9 c.G546A基因多态性和DOR及体外受精（IVF）结局密切相关。在DOR组中，携带GDF-9 c.G546A等位基因（GA/AA基因型）与携带GDF-9 546GG等位基因（GG基因型）相比，卵巢低反应的发生率增高（64.7%vs.23.6%）。此外，在控制性超排卵中，DOR患者需要更大剂量的重组人卵泡刺激素（rFSH），但是获得的受精率、优质胚胎数及妊娠率都较低。然而，在卵巢储备功能正常组中，携带GDF-9 c.G546A等位基因（GA/AA基因型）与携带GDF-9 546GG等位基因（GG基因型）相比，卵巢低反应的发生率、受精率、优质胚胎率以及妊娠率差异无统计学意义。据此推测GDF-9 c.G546A等位基因可能是导致DOR的原因。相继，该研究组在2例DOR患者中发现GDF-9存在新发突变c.G436T（p.R146C），但在卵巢功能正常人群中未检测到[22]。携带p.R146C的2例患者在IVF治疗中均发生卵巢低反应。该突变导致蛋白产生减少，蛋白活性部分失活，影响蛋白的生物功能。提示GDF-9基因突变可能是导致DOR的重要原因。

2.2 FSHR生长卵泡在促性腺激素及性激素作用下发育成熟，生殖内分泌相关基因突变可影响卵泡的募集、生长等功能。FSH是由垂体前叶产生的一种糖蛋白，在排卵前主要负责卵泡的形成和募集。其受体FSHR是G蛋白耦联受体，主要位于卵巢颗粒细胞上。FSHR基因包含一个大外显子和九个较小的外显子，分别编码跨膜胞内结构域及细胞外结构域。FSH与相应受体结合以后，激活下游的环磷酸腺苷-蛋白激酶A（cAMP-PKA）信号通路，引起靶蛋白发生磷酸化，从而参与并维持正常的性腺发育和生殖功能[23]。FSHR基因第680位点的多态性可能是导致卵巢反应性差异的重要因素。一项研究通过提取108例不孕妇女外周血基因组DNA，用聚合酶链式反应-限制性内切酶片段长度多态性（PCR-RFLP）检测扩增FSHR基因外显子10的片段并测序，研究该基因第680位点多态性。根据第680位是天冬酰胺（Asn）或丝氨酸（Ser）分为Asn/Asn、Asn/Ser和Ser/Ser型。Asn/Asn型全部是正常卵巢反应；而Asn/Ser型中卵巢正常反应占64.8%、卵巢低反应占21.1%、卵巢高反应占14.1%；Ser/Ser型中卵巢反应均不正常，卵巢低反应占46.7%、卵巢高反应占53.3%，表明FSHR基因第680 位点多态性与卵巢反应性有关[24]。Livshyts等[25]研究也发现，FSHR基因第680位氨基酸从天冬酰胺（Asn）变为丝氨酸（Ser），在卵巢低反应人群中出现频率高达26%，而在卵巢正常反应组中仅7.7%，差异有统计学意义（P＜0.01）。尽管基因分型研究的样本量很小，但都提示携带该基因型患者发生DOR的可能性较高。

2.3 ESR1该基因编码雌激素受体α，并与雌激素相互作用，调控性腺激素释放，在颗粒细胞增殖和卵泡生成过程中发挥重要作用。目前，在人类雌激素受体发现了两种亚型：α和β[26]，分别由ESR1和ESR2基因表达。ESR1位于6q25.1染色体上，由8个外显子组成；ESR2位于14q23.2号染色体上，由8个外显子组成。在卵巢内，α受体通常在卵泡膜细胞中表达更多，而β受体在颗粒细胞中表达[27]。M′Rabet等[28]研究发现位于ESR1基因内含子1的PvuⅡ多态性变异在不育女性中的发生率是正常女性的两倍，提示ESR1-PvuⅡ多态性可能导致POF。Livshyts等[29]分析卵巢储备受损患者和卵巢储备功能正常人群（年龄＜35岁为对照组Ⅰ；＞35岁对照组Ⅱ）的ESR1-PvuⅡ多态性（rs2334693），卵巢储备受损组的p-等位基因频率（-397T）为59.7%，卵巢储备功能正常人群组（对照组Ⅰ）的p-等位基因频率（-397T）为48.0%，卵巢储备功能正常人群组（对照组Ⅱ）为45.3%，差异均有统计学意义（P＜0.05），表明ESR1-PvuⅡ多态性与卵巢储备功能有关，提示该多态性可能是DOR的危险因素之一。

3 DOR与端粒长度的关系

端粒是位于染色体末端的DNA-蛋白结构，由TTAGGG重复序列和大量的端粒结合蛋白组成。端粒长度通常由端粒酶维持。端粒酶核心有两个必需组分：端粒酶RNA （TERC） 和角化不良蛋白（Dyskerin，DKC）组成。端粒酶RNA作为端粒延长的模板，角化不良蛋白则参与稳定端粒酶的组成。由于末端复制问题，在端粒酶缺乏的情况下，端粒逐渐缩短。端粒酶基因（如TERC，DKC）突变的患者表现出端粒缩短、POF及其相关疾病[30]。在卵泡发育过程中，颗粒细胞维持端粒酶的活性以利于增殖分化，颗粒细胞则与卵母细胞相互作用，影响卵泡发生、发育及卵子质量。研究发现卵母细胞和颗粒细胞的端粒缩短被认为是卵母细胞和卵泡质量降低的征兆[31]。POI患者表现为颗粒细胞端粒缩短加快[32]。一项研究通过实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）估算颗粒细胞的端粒长度，结果表明和正常组（卵巢功能正常）的端粒长度（1.07±0.27）相比，POI患者的端粒长度较短（0.93±0.23），差异有统计学意义（P=0.000 6）[33]。提示端粒长度变化可能也与DOR有关。但其相关机制尚不清楚，需要进一步研究DOR与颗粒细胞端粒长度的关系，为发掘临床诊治策略提供更多理论基础。

4 展望

综上所述，DOR是一种由多因素相互作用导致的复杂疾病，目前在大多数情况下病因仍不明确。因此深入研究DOR的发病机制及致病基因，不仅有助于了解卵巢功能的分子基础，而且能为临床高危险人群进行遗传咨询提供理论依据。未来随着DNA测序技术的不断发展，为寻找新的DOR易感位点或候选基因提供了高效的筛选手段，与病理性DOR相关联的基因多态性、基因突变和表观遗传因素将会相继发现。将来在进行卵巢刺激辅助生殖助孕之前，对该类患者进行基因筛查，为临床提供新颖的靶向治疗方法。